Gap-PCR چیست؟ آشنایی کامل با تکنیک Gap-PCR

مقدمه‌ای بر Gap-PCR

تنوعات ژنتیکی

به طور کلی برای تغییراتی که در سطح ژنوم اتفاق می افتند دسته بندی های متنوعی وجود دارد.یکی از دسته بندی ها، دسته بندی براساس اندازه ی تغییر می باشد. برخی تغییرات تک نوکلئوتیدی هستند و گروه دیگری از تغییرات بیش از یک نوکلئوتید را تحت تاثیر قرار می دهند. حذف شدگی ها و مضاعف شدگی ها(deletions and duplications) از جمله ی تغییراتی هستند که بیش از یک نوکلئوتید را تحت تاثیر قرار می دهند.

حذف شدگی ها و اضافه شدگی هایی که به طور مکرر در افراد متفاوت دیده می شود توسط مکانیسم NAHR(non-allelic homolog recombination) ایجاد می شود.همچنین کراسینگ اور نابرابر نیز از جمله علل ایجاد حذف شدگی ها و اضافه شدگی ها می باشد.روشن است که هر تغییر را با تکنیک مختص خودش باید تشخیص داد.

کاربردهای روش Gap-PCR

Gap-PCR یک تکنیک سریع، ساده، ارزان و مبتنی بر PCR است که هم قابلیت تشخیص حذف شدگی ها و اضافه شدگی ها (deletions and duplications) ی ژن ها را داشته و هم در زمینه های تحقیقاتی و هم در تشخیص جهش های بیماری زا کاربرد دارد. گاهی اوقات واریانت ها در دسته ی جهش قرار گرفته و گاهی هم پلی مورفیسم محسوب می شوند.

اگر فراوانی واریانت ها بالای 1 درصد در جامعه باشد و تغییر قابل ملاحظه و چشم گیری روی فنوتیپ نداشته باشند، پلی مورفیسم محسوب می شوند. جهش ها فراوانی کمتر از 1درصد در جامعه داشته و می توانند به طور مستقیم منجر به بیماری شوند. بررسی پلی مورفیسم هایی که در آنها حذف یا اضافه شدگی اتفاق افتاده و ارتباط احتمالی آن ها به یک فنوتیپ خاص از جمله کاربرد های Gap-PCR در زمینه تحقیقات است.

به طور مثال برای تحقیق در زمینه ی یک duplication  با طول  120bpدرپروموتر ژن DRD4 و ارتباط آن با بیماری اوتیسم از روش Gap-PCR استفاده می شود. در مورد کاربرد Gap-PCR در تشخیص می توان به تشخیص جهش های حذفی روی ژن بتا گلوبین که منجر به بیماری بتا تالاسمی می شود اشاره نمود.

حداقل 80 جهش حذفی بزرگ روی خوشه ی ژنی بتا گلوبین درپایگاه داده ی  HbVar (پایگاه داده ی واریانت های انسانی هموگلوبین) ذکر شده است. اگرچه که این روش برای اینکه به عنوان یک ابزار تشخیصی بتواند مورد استفاده قرار گیرد، نیاز به کنترل های مثبت دارد و جهش هدف باید به خوبی شناخته شده باشد. داشتن کنترل های مثبت برای بهینه کردن و تایید Gap-PCR بسیار مهم است. با استفاده از روش Gap-PCR می توان ژنوتیپ افراد را در آن لوکوس دارای حذف یا اضافه شدگی تعیین کرد.

اصول روش Gap-PCR

در تکنیک Gap-PCR برای اطراف لوکوس دارای deletion و یا duplication پرایمر طراحی می شود و سپس ناحیه ی موردنظر توسط دستگاه ترمال سایکلر (Thermal cycler) تکثیر می شود.

چگونگی تشخیص واریانت ها به وسیله Gap-PCR تبه این نحو است که، سایز محصول PCR بدون حذف و یا اضافه شدگی متفاوت از سایز محصول بعد از حذف و یا اضافه شدگی در ژن مورد نظر می باشد. در نتیجه می توان بعد از الکتروفورز محصولات PCR باتوجه به تعداد باندها و سایز باندهای مشاهده شده تعیین ژنوتیپ را انجام داد.

به طور مثال اگر بخواهیم افراد را از نظر 120bp Duplication روی ژن DRD4 (مثالی که بالا ذکر شد از کاربرد Gap-PCR در تحقیقات) تعیین ژنوتیپ کنیم، می دانیم که سایز محصول PCR بدون duplication 429 جفت باز و قاعدتا با Duplication 549 جفت باز خواهد بود.

بنابراین اگرژنوتیپ فرد هتروزیگوت باشد، توقع می رود که دو باند با دوسایز مختلف (429 و 549 جفت باز) روی ژل آگارز تشکیل شود، اگر هموزیگوت بدون Duplication باشد باید تنها یک باند 429 جفت بازی داشته و درحالتی که ژنوتیپ فرد هموزیگوت با Duplication باشد توقع می رود که یک باند 549 جفت بازی روی ژل آگارز تشکیل شود.

نتیجه ی Gap-PCR

با توجه به اندازه ی ناحیه ی تغییر یافته الکتروفورز افقی یا عمودی را برای بررسی نتیجه ی Gap-PCR انتخاب می کنیم. برای حذف ها یا اضافه شدگی های کمتر از 30bp از الکتروفورز عمودی (ژل آکریل آمید) که قدرت تفکیک بالاتری دارد استفاده می شود و تغییرات بزرگتر از 30bp با استفاده از ژل آگارز قابل شناسایی هستند.

شما میتوانید با شرکت در دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی این تکنیک را بصورت عملی یاد بگیرید و اجرا کنید

 

منبع

Bilgen T, Altıok Clark Ö, Öztürk Z, Yeşilipek MA, Keser İ. Gap-PCR Screening for Common Large Deletional Mutations of β-Globin Gene Cluster Revealed a Higher Prevalence of the Turkish Inversion/Deletion (δβ)0 Mutation in Antalya. Turk J Haematol. 2016 Jun 5;33(2):107-11. doi: 10.4274/tjh.2014.0242. Epub 2015 Aug 6. PMID: 26377447; PMCID: PMC5100720.

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

5 / 5. تعداد رای دهندگان: 2

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *