رنگ آمیزی پپتید هیبرید کننده کلاژن: اصول، اهداف، روش

فهرست مطالب نمایش

رنگ آمیزی پپتید هیبرید کننده کلاژن چیست؟

کلاژن بلوک اصلی ساختمان همه بافت‌ها از جمله تاندون، رباط، قرنیه، غضروف و استخوان است. این پروتئین یک ساختاری فیبری است که از یک بافت رشته سه‌تایی از هلیکس‌های (Helix) راست‌گرد پلی‌پرولین نوع II (Polyproline II-type) چپ‌گرد موازی تشکیل شده است.

کلاژن می‌تواند در طول رشد، تحت تغییر شکل گسترده پروتئولیتیک (Proteolytic) قرار گیرد که باعث تخریب کلاژن شده و منجر به بروز انواع بیماری‌های تهدید کننده زندگی مانند سرطان استخوان (استئوآرتریت (Osteoarthritis))، انفارکتوس میوکارد (Myocardial infarction)، گلومرولونفریت (Glomerulonephritis) و فیبروز ریوی (Pulmonary fibrosis) می‌شود. همچنین می‌توان از آن برای تشخیص تغییر شکل استخوان جنینی و پیری پوست استفاده کرد.

روش‌های مرسوم برای تشخیص این نوع تخریب‌های کلاژن دشوار است و بنابراین یک پپتید طراحی شده (پپتید هیبرید کننده کلاژن (CHP))، که کلاژن تخریب شده را هیبرید می‌کند ساخته شد. پپتید هیبرید کننده کلاژن (CHP) یک توالی پپتیدی مصنوعی با 6 تا 10 واحد تکراری از اسید آمینه سه گانه Gyl-Xaa-Yaa است که از توالی کلاژن طبیعی تقلید می‌کند. پپتید CHP دارای محتوای بالایی از پرولین (Proline) و هیدروکسی‌پرولین (Hydroxyproline) در موقعیت Xaa-Yaa است که به آن میل زیادی برای تشکیل ترکیب مارپیچ سه گانه را می‌دهد.

زنجیره پپتیدی مونومری توانایی شناسایی رشته‌های کلاژن دناتوره شده (Denatured) در بافت‌های بدن را با تشکیل یک مارپیچ سه گانه هیبرید شده با رشته کلاژن دارد.

این مکانیسم توسط زنجیره‌های مارپیچ سه‌گانه (Gly-Xaa-Yaa) و زنجیره پیوندهای هیدروژنی شبیه به قطعات DNA که به رشته‌های DNA مکمل بازریخت (Anneal) می‌شوند، فعال می‌شود. CHP بسیار اختصاصی است و میل ترکیبی ناچیزی نسبت به مولکول‌های کلاژن دست نخورده به دلیل عدم وجود مکان‌های اتصال دارد. همچنین به دلیل ماهیت خنثی و آب‌دوستی (Hydrophilic) نسبت به اتصال غیر اختصاصی فاقد قدرت واکنش است.

اهداف رنگ آمیزی پپتید هیبرید کننده کلاژن

برای تشخیص و نشان دادن وجود پیوندهای کلاژن دناتوره شده

اصول رنگ آمیزی پپتید هیبرید کننده کلاژن

رنگ پپتید هیبرید کننده کلاژن یک رنگ خاص است که در زیست شناسی، بافت شناسی و هیستوپاتولوژی تکوینی برای شناسایی و نشان دادن وجود بافت‌های تخریب شده کلاژنی استفاده می‌شود.

CHP قویاً ماتریکس سلولی تخریب شده توسط جابجایی پروتئولیتیک (Proteolytic) سلول‌های ملتهب در یک کشت کلاژن را تصویرسازی می‌کند. صدمات مکانیکی موضعی را می‌توان با CHP در سطح مولکولی شامل بررسی دناتوره شدن بافت‌های کلاژن در سطح ماتریکس خارج سلولی، تعیین کرد. به کارگیری آن با SDS-PAGE امکان تصویرسازی باندهای کلاژنی را بدون استفاده از تکنیک وسترن بلات (Western blotting technique) می‌دهد.

CHP در هنگام ذخیره سازی دوباره به آرامی به صورت مارپیچ‌های سه‌گانه در محلول در می‌آید، یدبنابراین نمی‌تواند رشته‌های کلاژن باز شده را هیبرید کند. از این رو قبل از استفاده باید با حرارت دادن به صورت مونومرها جدا شود. تشکیل تریمرها (Trimer) (تریمریزاسیون (trimerization)) در غلظت‌های پایین توسط CHP حتی ساعت‌ها طول می‌کشد، زیرا CHP تفکیک شده با حرارت می‌تواند به عنوان یک رشته فعال برای هیبریداسیون کلاژن دناتوره شده باقی بماند.

حرارت دادن CHP تا دمای 80 درجه سانتی‌گراد در بن‌ماری (Water bath) پس از رقیق سازی، پروتکل رایج ایده‌آل می‌باشد. این پروتکل عبارت است از حرارت دادن محلول CHP (پس از رقیق شدن تا غلظت مورد نظر) و خنک کردن سریع آن تا دمای اتاق و سپس استفاده فوری برای هدف قرار دادن سوبستراهای کلاژن، همانطور که در زیر به تفصیل توضیح داده شده است. ممکن است یک بلوک حرارت دهی و یک حمام آب یخ در بیشتر موارد مورد نیاز باشد.

عملا CHP را می‌توان با بیوتین (Biotin) برای شناسایی با واسطه آویدین/ استرپتاویدین (Avidin/ Streptavidin) برچسب گذاری کرد.

شناساگرها

پودر پپتید
آب بافر فسفات (Phosphate buffered water)
بیوتین
نمک بازی

روش رنگ آمیزی پپتید هیبرید کننده کلاژن

3 میلی‌گرم پودر پپتید (بیوتین CHP) را در 1 میلی‌لیتر آب خالص یا محلول نمک بافر فسفات (Phosphate-Buffered Saline) (1x PBS) حل کنید.
خوب آن را مخلوط و سانتریفیوژ کنید تا یک محلول ذخیره با حداقل 100 میکرومولار CHP تهیه شود (محلول ذخیره را در دمای 4 درجه سانتی‌گراد نگه‌داری کنید).
محلول ذخیره را بسته به غلظت مورد استفاده رقیق کنید. مثال: برای پودر 60 میکروگرم، آن را در 400 میکرولیتر آب یا PBS حل کنید تا محلول ذخیره‌ای با غلظت CHP برابر 50 میکرومولار به دست آید.
بسته به بافت مورد آزمایش، نمونه را با سرم 10% یا BSA 5% بلاک کنید، مخصوصاً هنگام رنگ آمیزی همزمان با آنتی‌بادی. (برای انواع بافت‌های خاص، به عنوان مثال کلیه، ممکن است لازم باشد که بیوتین درون‌زا (Endogenous) را با استفاده از یک کیت استاندارد برای رنگ آمیزی B-CHP بلاک کنید.)
محلول ذخیره CHP را در بافر PBS با یک غلظت متوسط از نمونه، رقیق کنید.
CHP رقیق شده را در یک بن‌ماری با دمای کنترل شده 80 درجه سانتی‌گراد به مدت 5 دقیقه گرم کنید
برای جلوگیری از آسیب دیدن نمونه بافت با حرارت، فورا CHP گرم شده را در یک میکروتیوب (Microtube) در حمام آب یخ به مدت 15 تا 90 ثانیه قرار دهید.
بلافاصله میکروتیوب سرد شده را سانتریفیوژ کنید تا تغلیظ شده در لوله جمع شود و سپس محلول را با پیپت (Pipet) به هر بافت نمونه اضافه کنید.
برای دستیابی به نتایج بهتر، بافت‌ها را با محلول رنگ آمیزی در دمای 4 درجه سانتی‌گراد به مدت 2 ساعت یا یک شب انکوبه کنید.
اسلایدهای بافت را در PBS به مدت 5 دقیقه در سه نوبت در دمای اتاق بشویید.
بسته به رنگ نمونه: