میکروتوم

میکروتوم از یونانی mikros ، به معنی “کوچک” ، و temnein ، به معنی “برش” ابزاری است که برای برش ورقه های بسیار نازک از مواد استفاده می شود. میکروتوم ها در علم بسیار مهم هستند زیرا برش های آن امکان تهیه نمونه ها برای مشاهده تحت نور منتقل شده یا تابش الکترون را فراهم می کند.

میکروتومها بسته به قطعه قطعه شدن نمونه و برش ضخامت مورد نظر ، از تیغه های استیل ، شیشه یا الماس استفاده می کنند. از تیغه های فولادی برای تهیه بخشهایی از بافتهای حیوانی یا گیاهی برای بافت شناسی میکروسکوپ نوری استفاده می شود. از تیغ های شیشه ای برای برش مقاطع برای میکروسکوپ نوری و برش بخشهای بسیار نازک برای میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود. از تیغ های الماس درجه صنعتی برای برش دادن مواد سخت مانند استخوان ، دندان و مواد گیاهی برای میکروسکوپ نوری و میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود. از تیغ های الماس با کیفیت گوهر برای برش بخشهای نازک برای میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود.

میکروتومی یک روش برای تهیه مقاطع نازک برای موادی مانند استخوان ، مواد معدنی و دندان ها و جایگزینی برای الکتروپولیش و فرز یونی است. بخشهای میکروتوم را می توان به اندازه کافی نازک کرد تا موی انسان را در عرض خود گسترش دهد ، و ضخامت آن بین 50 نانومتر تا 100 میکرومتر باشد.

تاریخچه

در آغاز توسعه میکروسکوپ نوری ، بخشهایی از گیاهان و حیوانات به صورت دستی و با استفاده از تیغ ها تهیه شد. مشخص شد که برای مشاهده ساختار نمونه تحت مشاهده ، انجام برش های قابل تکرار تمیز به میزان 100 میکرومتر که از طریق آن می توان نور را انتقال داد ، مهم است. این امر برای مشاهده نمونه ها با استفاده از میکروسکوپ های نوری در حالت انتقال امکان پذیر است.

در سال 1835 ، اندرو پریچارد یک مدل مبتنی بر جدول را ایجاد کرد که اجازه می داد با چسباندن دستگاه به میز ، لرزش جدا شود و اپراتور را از تیغ جدا کند.

منابع دیگر این پیشرفت را به یان اوانژلیستا پوركینو ، متخصص فیزیولوژیك چک نسبت می دهند. چندین منبع مدل پوركین را به عنوان اولین مورد استفاده عملی توصیف كرده اند.

مبهم بودن منشأ میکروتوم به این دلیل است که اولین میکروتوم ها دستگاههای برش بودند و مرحله رشد دستگاههای اولیه بسیار مستند نیست.

در پایان دهه 1800 ، توسعه نمونه های بسیار نازک و مداوم توسط میکروتومی ، همراه با رنگ آمیزی انتخابی اجزای مهم سلول یا مولکول ها ، برای تجسم جزئیات میکروسکوپ امکان پذیر است.

امروزه ، اکثر میکروتوم ها یک طرح بلوک تیغ با یک تیغ قابل تغییر ، یک نگهدارنده نمونه و یک مکانیزم پیشرفت هستند. در بیشتر دستگاه ها ، برش نمونه با حرکت نمونه بر روی تیغ آغاز می شود ، جایی که مکانیزم پیشرفت به طور خودکار به جلو حرکت می کند به طوری که می توان برش بعدی را برای ضخامت انتخاب شده ایجاد کرد. ضخامت مقطع توسط مکانیزم تنظیم کنترل می شود و امکان کنترل دقیق را فراهم می کند.

کاربرد ها

رایج ترین کاربردهای میکروتوم ها عبارتند از:

• روش بافت شناسی سنتی

بافت ها ثابت ، کم آب ، پاک شده و در پارافین ذوب شده قرار می گیرند ، که با خنک شدن یک بلوک جامد تشکیل می شود. سپس بافت در ضخامت های مختلف از 2 تا 50 میکرومتر در میکروتوم بریده می شود. از آنجا می توان بافت را بر روی اسلاید میکروسکوپ سوار کرد ، پس از حذف پارافین با رنگ (های) مناسب آبی رنگ آمیزی کرد و با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی کرد.

• روش برش یخ زده

بافتهای غنی از آب در اثر یخ زدن سخت شده و در حالت منجمد با میکروتوم انجماد یا میکروتوم-کریوستات برش داده می شوند بخشها رنگ آمیزی و با میکروسکوپ نوری بررسی می شوند. این روش بسیار سریعتر از بافت شناسی سنتی است (5 دقیقه در مقابل 16 ساعت) و همراه با اقدامات پزشکی برای دستیابی به یک تشخیص سریع استفاده می شود. Cryosections همچنین می تواند در ایمونوهیستوشیمی مورد استفاده قرار گیرد زیرا انجماد بافت تخریب بافت را سریعتر از استفاده از ماده ثابت کننده متوقف می کند و ترکیب شیمیایی آن را تغییر نمی دهد یا آن را پنهان نمی کند.

• تکنیک میکروسکوپ الکترونی

پس از جاسازی بافت ها در رزین اپوکسی ، از میکروتوم مجهز به تیغی الماس با درجه شیشه یا سنگ قیمتی برای برش بخشهای بسیار نازک (به طور معمول 60 تا 100 نانومتر) استفاده می شود. بخشها با محلول آبی یک نمک فلز سنگین مناسب رنگ آمیزی شده و با میکروسکوپ الکترونی عبوری بررسی می شوند. این ابزار را اغلب اولترا میکروتوم می نامند. اولترا میکروتوم همچنین با تیغی شیشه ای یا تیغی الماس درجه صنعتی برای برش مقاطع پیش از برش نازک استفاده می شود ضخامت این بخشهای بررسی به طور کلی 0.5 تا 1 میکرومتر است و بر روی لام شیشه ای سوار شده و رنگ آمیزی می شود تا قبل از برش نازک برای TEM ، مناطق مورد نظر را زیر میکروسکوپ نوری قرار دهد. برش نازک برای TEM اغلب با تیغی الماس با کیفیت سنگهای قیمتی انجام می شود. تکمیل تکنیک های TEM سنتی ultramicrotomes به طور فزاینده ای در داخل محفظه SEM نصب می شوند ، بنابراین می توان سطح صورت بلوک را تصویربرداری کرد و سپس با میکروتوم جدا کرد تا سطح بعدی را برای تصویربرداری کشف کند. به این روش میکروسکوپ الکترونی روبشی سری بلوک صورت (SBFSEM) گفته می شود.

• تکنیک Botanical Microtome

مواد سخت مانند چوب ، استخوان و چرم نیاز به میکروتوم سورتمه دارند. این میکروتوم ها تیغه های سنگین تری دارند و نمی توانند به اندازه میکروتوم معمولی نازک شوند.

• روش طیف سنجی (به ویژه FTIR یا طیف سنجی مادون قرمز)

برای اینکه پرتو مادون قرمز به نمونه مورد بررسی نفوذ کند ، به بخشهای نازک پلیمری نیاز است. برش نمونه ها با ضخامت بین 20 تا 100 میکرومتر طبیعی است. برای تجزیه و تحلیل دقیق تر از مناطق بسیار کوچکتر در یک بخش نازک ، می توان از میکروسکوپ FTIR برای بازرسی نمونه استفاده کرد.

پیشرفت اخیر ، میکروتوم لیزر است که نمونه مورد نظر را به جای تیغ مکانیکی با لیزر فمتوثانیه برش می دهد. این روش بدون تماس است و به تکنیک های تهیه نمونه نیاز ندارد. میکروتوم لیزر توانایی برش تقریباً هر بافت را در حالت اصلی خود دارد. بسته به ماده در حال پردازش ، ضخامت ورقه های 10 تا 100 میکرومتر امکان پذیر است.

انواع میکروتوم آزمایشگاهی

1. Sledge

میکروتوم سورتمه وسیله ای است که در آن نمونه در یک نگهدارنده ثابت (شاتل) قرار می گیرد ، سپس در پشت تیغ به عقب و جلو حرکت می کند. میکروتوم های سورتمه مدرن ، سورتمه را روی یاتاقان خطی قرار داده اند ، طرحی که به میکروتوم اجازه می دهد بسیاری از بخشهای درشت را به راحتی برش دهد. با تنظیم زاویه های بین نمونه و تیغی میکروتوم می توان از فشار وارد شده به نمونه در هنگام برش کاسته شود. برنامه های معمول برای این طراحی میکروتوم تهیه نمونه های بزرگ مانند نمونه هایی است که برای تهیه بیولوژیکی در پارافین تعبیه شده است. ضخامت برش معمول قابل دستیابی بر روی میکروتوم سورتمه بین 1 تا 60 میکرومتر است.

• Rotary

این وسیله یک طرح میکروتوم رایج است. این دستگاه با یک عمل چرخشی مرحله ای کار می کند به طوری که برش واقعی بخشی از حرکت چرخشی است. در یک میکروتوم دوار ، تیغ به طور معمول در موقعیت افقی ثابت می شود.

در شکل زیر، اصل برش توضیح داده شده است. از طریق حرکت نگهدارنده نمونه ، نمونه توسط موقعیت تیغ 1 به موقعیت 2 بریده می شود ، در این مرحله قسمت تازه روی تیغ باقی می ماند. در بالاترین نقطه حرکت چرخشی ، نگهدارنده نمونه با همان ضخامت قطعه ای که قرار است ساخته شود ، پیشرفت می کند و اجازه می دهد تا قسمت بعدی ساخته شود.

چرخ دنده موجود در بسیاری از میکروتوم ها را می توان با دست فعال کرد. این مزیت این را دارد که می توان برش تمیزی ایجاد کرد ، زیرا جرم نسبتاً زیاد چرخ دنده از توقف نمونه در هنگام برش نمونه جلوگیری می کند. چرخ دنده در مدل های جدید غالباً درون محفظه میکروتوم قرار دارد. ضخامت برش معمول یک میکروتوم دوار بین 1 تا 60 میکرومتر است. برای مواد سخت ، مانند نمونه ای که در یک رزین مصنوعی جاسازی شده است ، این طرح میکروتوم می تواند مقاطع خوب “نیمه نازک” با ضخامت حداقل 0.5 میکرومتر را فراهم کند.

• Cry microtome

برای برش نمونه های یخ زده ، میکروتوم های دوار بسیاری را می توان به گونه ای تنظیم کرد که در یک محفظه نیتروژن مایع ، در اصطلاح تنظیم کرایومایکروتوم ، برش داده شوند. کاهش دما اجازه می دهد تا سختی نمونه افزایش یابد. با این وجود برای بهینه سازی ضخامت نمونه باید دمای نمونه و دمای تیغ کنترل شود.

• Ultramicrotome

اولترا میکروتوم ابزار اصلی اولترا میکروتومی است. این دسگاه امکان آن را می دهد تا بخشهای بسیار نازکی را تهیه کنید ، با عملکرد دستگاه به همان روشی که میکروتوم چرخشی دارد ، اما با تحمل بسیار محکم در ساختار مکانیکی. در نتیجه ساخت مکانیکی دقیق ، از انبساط حرارتی خطی برای کنترل بسیار خوب ضخامت استفاده می شود.