لام گیری

مقدمه‌ای بر لام گیری

سلول های متوقف شده در مرحله متافاز به کمک محلول پتاسیم کلرید تورژسانس شده و سپس با مخلوط متانول و اسید استیک، فیکس می شوند. سلول های باد کرده این بار از فاصله چند سانتی متری به وسیله قطره چکان پرتاب می شوند. با این روش غشای سلول پاره شده و کروموزوم های هر سلول به طور مجزا و متمرکز روی لام ظاهر می شوند. لام ها را از چند ساعت تا چند روز در دمای مشخص برای بالا بردن وضوح باند ها انکوبه می کنند. این مرحله aging نامیده می شود.

در مرحله لام گیری بهتر است ابتدا به روش های مختلف از یک نمونه لام تهیه کرده و هر بار متافاز ها را از نظر پخش شدگی و یا روی هم افتادگی زیر میکروسکوپ بررسی کرده و در نهایت بهترین لام ها را برای رنگ آمیزی کاندید کنیم. توجه شود که کروموزوم های سلول های پرتاب شده نباید بیش از حد پراکنده و یا روی هم افتاده باشند.

کاریوتایپ  بر روی نمونه خون گرفته شده از فرد، انجام می‌گیرد. مراحل کلی آزمایش کاریوتایپ به شرح زیر است:

در کمتر از ۲۴ ساعت خون به مرکز ژنتیک انتقال داده می‌شود. ابتدا کشت کروموزومی انجام می‌شود و سپس برداشت از کروموزوم‌ها انجام شده و بعد لام گیری انجام می‌شود و کروموزوم‌ها رنگ‌آمیزی می‌شوند و در آخر کروموزوم‌ها را زیر میکروسکوپ آنالیز می‌کنند، تا هر گونه اختلال و ناهنجاری تشخیص داده شود.

یک لام حاوی گستره‌ی سلولی می‌تواند یک پیش نمایش مناسب از کیفیت کشت سلولی را به ما بدهد قبل از اینکه مراحل بعدی از جمله:  G-banding, FISH, CGH یا SKY را شروع کنیم.

هاروِست(برداشت) مرحله دوم از آزمایش کاریوتایپ خون:

هاروست سلول‌ها، یعنی جمع آوری سلول‌های در حال تقسیم در مرحله متافاز، تیمار با محلول هایپوتونیک، تثبیت و قرار دادن کروموزوم ها روی اسلاید شیشه‌ای. مرحله هاروست شامل دو گام است؛ گام اول باید میتوز را متوقف کنیم و گام دوم از بین بردن RBC و تورژسانس سلول‌های دیگر مثل T-Cell ها با استفاده از محلول هایپوتونیک است. بعد از ۷۲ ساعت که نمونه خون در انکوباتور قرار گرفت و سلول‌ها رشد کردند، تعداد کافی سلول درحال تقسیم بدست می‌آید؛ سپس این سلول‌ها جمع آوری می‌شوند.

بعد از کلسمید یک محلول هیپوتونیک به سلول‌ها اضافه می‌شود. همانطور که می‌دانید محلول هیپوتونیک غلظت نمکی کمتر از  سیتوپلاسم(خون) دارد بنابراین طبق پدیده اسمز باعث حرکت آب از خارج به داخل سلول ها(گلبول های قرمز) می‌شود و گلبول‌های قرمز خون متورم می‌شوند.

محلول هایپوتونیک در واقع باعث همولیز گلبول قرمز خون شده، که این امر برای پراکنده شدن کروموزوم‌ها روی لام میکروسکوپ ضروری است. نکته خیلی مهم که باید بدانیم، این است که اگر سلول‌ها زمان زیادی در محلول هیپوتونیک قرار بگیرند پاره شده، و اگر زمان آن خیلی کوتاه باشد، سلول‌ها به میزان کافی متورم نشده و بنابراین کروموزوم‌ها از هم جدا نمی‌شوند.

مرحله بعدی فیکس کردن سلول‌هاست. در مرحله فیکس کردن باید سلول کشته شده و ساختارهای درونی بدون آسیب تثبیت شوند که برای این کار از محلول فیکساتیو استفاده می‌شود. این محلول از سه بخش متانول و یک بخش اسید استیک تشکیل شده. برای متوقف کردن اثر محلول هیپوتونیک و همینطور برای تثبیت سلول‌ها در حالت متورم، از تثبیت کننده استفاده می‌کنیم. از آنجایی‌که تثبیت کننده از محیط آب جذب می‌کند و تاثیر منفی بر کیفیت و رنگ‌آمیزی کروموزوم‌ها می‌گذارد بنابراین همیشه باید تازه تهیه شود. این تثبیت کننده همه گلبول‌های قرمز که در نمونه وجود دارد را لیز می‌کند.

سلول‌های باد کرده این بار از فاصله چند سانتی‌متری به وسیله قطره چکان پرتاب می‌شوند. با این روش غشای سلول پاره شده و کروموزوم‌های هر سلول به طور مجزا و متمرکز روی لام ظاهر می‌شوند. لام‌ها را از چند ساعت تا چند روز در دمای مشخص برای بالا بردن وضوح باند‌ها انکوبه می‌کنند. این مرحله aging نامیده می‌شود.

در مرحله لام گیری بهتر است ابتدا به روش‌های مختلف از یک نمونه لام تهیه کرده و هر بار متافازها را از نظر پخش شدگی و یا روی هم افتادگی زیر میکروسکوپ بررسی کرده و در نهایت بهترین لام‌ها را برای رنگ‌آمیزی کاندید کنیم. توجه شود که کروموزوم‌های سلول‌های پرتاب شده نباید بیش از حد پراکنده و یا روی هم افتاده باشند.

مطالعات بیشتر در بخش ویکی‌ژن سایت