تست ساتلیتیسم: اصول، محیط، روش انجام، نتایج و موارد استفاده

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تست ساتلیتیسم

گونه‌های هموفیلوس (Haemophilus) برای رشد و بقا به یک یا هر دو فاکتور X (همین (Hemin) یا پروتوپورفیرین IX (Protoporphyrin IX)) و فاکتور V (نیکوتین آدنین دی‌نوکلئوتید (Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD))) نیاز دارند. گونه‌های هموفیلوس را می‌توان تا سطح گونه بر اساس این‌که آیا آن‌ها به یکی یا هر دوی این فاکتورهای رشد نیاز دارند، متمایز کرد.

تست ساتلیتیسم یکی از تست‌های بیوشیمیایی است که برای تشخیص هموفیلوس آنفولانزا (Haemophilus influenzae) از سایر گونه‌های هموفیلوس بر اساس نیاز افتراقی به فاکتور X و فاکتور V، استفاده می‌شود.

هموفیلوس آنفولانزا برای رشد خود به هر دو فاکتور X و V نیاز دارد در حالی که بسیاری از دیگر گونه‌های هموفیلوس بیماری‌زای رایج، فقط به یکی از دو فاکتور رشد نیاز دارند.

اهداف تست ساتلیتیسم

شناسایی هموفیلوس آنفولانزا

اصول تست ساتلیتیسم

محیط کشت بلاد آگار (Blood agar) فقط فاکتور X را فراهم می‌کند، اما برای فراهم کردن فاکتور V، گلبول‌های قرمز موجود در بلاد آگار باید همولیز (Hemolyze) شوند. هموفیلوس آنفولانزا نه می‌تواند خون را همولیز کند و نه بدون فاکتور V رشد می‌کند، بنابراین هموفیلوس آنفولانزا به تنهایی نمی‌تواند در محیط بلاد آگار رشد کند.

استافیلوکوکوس اورئوس (Staphylococcus aureus) همولیتیک (hemolytic) است و وجود آن در محیط کشت بلاد آگار باعث می‌شود فاکتور V (NAD) در محیط در دسترس شود. از این رو هموفیلوس آنفولانزا می‌تواند در مجاورت کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس در محیط کشت بلاد آگار رشد کند. این پدیده “ساتلیتینگ” (Satelliting) نامیده می‌شود.

نیازمندی‌های تست ساتلیتیسم

محیط کشت

برای انجام این تست از محیط کشت بلاد آگار استفاده می‌شود.

ترکیب محیط کشت پایه بلاد آگار در هر 1000 میلی‌لیتر

پپتون قلب گاو (Beef Heart Peptone): 10 گرم (به طور جایگزین، عصاره گوشت: 10 گرم)
پپتون: 10 گرم (به طور جایگزین، تریپتوز (Tryptose): 10 گرم)
کلرید سدیم: 5 گرم
آگار: 15 گرم
pH نهایی: 0.2 ± 7.3 در دمای 25 درجه سانتی‌گراد

روش آماده‌سازی پلیت بلاد آگار

مقدار مناسب از پودر بلاد آگار پایه (40 گرم از ترکیب فوق) را اندازه‌گیری کرده و طبق دستور شرکت سازنده در آب به حجم مورد نیاز در ارلن‌مایر (Conical flask) یا بطری شیشه‌ای مخلوط کنید.
با استفاده از یک همزن مغناطیسی (Magnetic stirrer) یا به صورت دستی خوب هم بزنید و حرارت دهید تا به جوش آمده و تمام اجزا و آگار کاملا در آب حل شود.
ارلن‌مایر یا بطری را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد و فشار 15 پوند به مدت 15 دقیقه اتوکلاو کنید و بگذارید تا دمای حدود 40 تا 45 درجه سانتی‌گراد خنک شود.
5 درصد (5 تا 10 درصد) حجمی/حجمی (V/V) خون گوسفند استریل دفیبرینه شده (Defibrinate) را به آرامی با هم زدن مداوم داخل ارلن‌مایر محتوی پایه بلاد آگار بریزید. خوب آن را مخلوط کنید تا خون به طور یکنواخت در محیط حل شود. این مخلوط، بلاد آگار می‌باشد.
در یک پلیت پتری (Petri plate) استریل (پلیت شیشه‌ای به قطر 10 سانتی‌متر)، حدود 25 میلی‌لیتر از بلاد آگار را ریخته و اجازه دهید با قرار دادن آن را در دمای اتاق، به خوبی جامد شود.

شناساگرها

هیچ شناساگری مورد نیاز نیست.

تجهیزات

پلیت‌های پتری

میکروپیپت (Micropipette)

سواب پنبه‌ای / لوپ تلقیح (Inoculating Loop)

ارگانیسم‌های مورد آزمایش

نمونه باکتری (گونه‌های هموفیلوس)
استافیلوکوکوس اورئوس ATCC 25923

ارگانیسم‌های کنترل

هموفیلوس آنفولانزا ATCC 35056
هموفیلوس همولیتیکوس ATCC 33390

روش انجام تست ساتلیتیسم

یک سوسپانسیون از کلنی‌های شناسایی شده گونه‌های هموفیلوس (یا مشکوک به هموفیلوس آنفولانزا) تهیه کنید.
یک سوسپانسیون از استافیلوکوکوس اورئوس تهیه کنید.
با استفاده از یک لوپ تلقیح استریل، سوسپانسیون را در یک پلیت محیط بلاد آگار رگه بزنید. (رگه زدن در یک جهت در امتداد پلیت، عمل خواندن نتایج را آسان خواهد نمود.)
با استفاده از یک لوپ استریل دیگر، یک لوپ پر از سوسپانسیون استافیلوکوکوس اورئوس را برداشته و در یک خط در میان گونه هموفیلوس تلقیح شده/رگه زده شده، رگه بزنید. (به طور عمود بر خطوط تلقیح گونه هموفیلوس)
پلیت را در دمای 2±35 درجه سانتی‌گراد به مدت حدود 24 ساعت با 5 درصد CO₂ انکوبه کنید.

نتیجه و تفسیر تست ساتلیتیسم

رشد کلنی‌های کوچک تنها در مجاورت کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس نشان دهنده حضور هموفیلوس آنفولانزا است.
هموفیلوس همولیتیکوس ( haemolyticus) و هموفیلوس پاراهمولیتیکوس (H. parahaemolyticus) ماهیت همولیتیک دارند. از این رو، می‌توانند در غیاب استافیلوکوکوس اورئوس رشد کنند.
رشد باکتری‌ها در سراسر پلیت، نزدیک و دور از کلنی‌های استافیلوکوکوس اورئوس – نشان دهنده وجود گونه‌های هموفیلوس است که آن‌ها یا فقط به فاکتور X نیاز دارند یا همولیتیک هستند.

موارد احتیاط

قبل از تلقیح از استریل بودن پلیت بلاد آگار و این که همولیز نشده باشد، اطمینان حاصل کنید.
هنگام انتقال کلنی‌های هموفیلوس برای تهیه سوسپانسیون، مطمئن شوید که هیچ بخشی از محیط شکلات آگار (Chocolate agar) منتقل نشده است.
در حضور 5 درصد CO2، عمل انکوباسیون را انجام دهید.

کاربردهای تست ساتلیتیسم

شناسایی گونه‌های هموفیلوس ایزوله شده به عنوان هموفیلوس آنفولانزا.
برای افتراق گونه‌های بروسلا (Brucella) از گونه‌های هموفیلوس.

محدودیت‌های تست ساتلیتیسم

قادر به جداسازی هموفیلوس آنفولانزا و هموفیلوس اژیپتیوس (aegyptius) نیست.
هموفیلوس دوکرئی ( ducreyi) در بلاد آگار حتی در حضور استافیلوکوکوس اورئوس رشد نمی‌کند.
ابتدا باید باکتری به عنوان یکی از اعضای گونه هموفیلوس با استفاده از رنگ‌آمیزی گرم (Gram) یا سایر آزمایشات بیوشیمیایی، شناسایی شود.
استرپتوکوک‌های واریته تغذیه‌ای (Nutritionally variant Streptococci (NVS)) مانند گونه‌های ابیوتروفیا دفکتیوا (Abiotrophia defective) و گرانولیکاتلا (Granulicatella)، گونه‌های نایسریا (Neisseria) و دیفتروئید (Diphtheroid) نیز در این تست، نتیجه مثبت ارائه می‌دهند.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه