کروماتوگرافی لایه نازک: اصول، اجزا، مراحل و موارد استفاده

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر کروماتوگرافی لایه نازک

کروماتوگرافی یک تکنیک بیوفیزیکی مهم است که جداسازی، شناسایی و خالص‌سازی اجزای یک مخلوط را جهت انجام آنالیز کمی و کیفی، ممکن می‌سازد.

در این روش فیزیکی جداسازی، اجزایی که قرار است جدا شوند بین دو فاز توزیع می‌شوند که یکی از آن‌ها ساکن (فاز ساکن (Stationary phase)) و دیگری (فاز متحرک (Mobile phase)) در جهت معینی حرکت می‌کند. بسته به فاز ساکن و فاز متحرک انتخاب شده، آن‌ها می‌توانند انواع مختلفی داشته باشند.

کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) چیست؟

کروماتوگرافی لایه نازک را می‌توان به عنوان روشی برای شناسایی یا جداسازی مخلوطی از ترکیبات به اجزای جداگانه با استفاده از جاذب جامدی (یا مایع) که به ذرات ریز تقسیم شده، روی پلیت (Plate) و جاذب مایع به عنوان یک فاز متحرک تعریف کرد.

اصول کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک بر روی ورقه‌ای از شیشه، پلاستیک یا فویل آلومینیومی که با لایه نازکی از مواد جاذب، معمولاً سیلیکا ژل (Silica gel)، اکسید آلومینیوم (Aluminium oxide) (آلومینا (Alumina)) یا سلولز (Cellulose) پوشانده شده است، انجام می‌شود. این لایه جاذب به عنوان فاز ساکن شناخته می‌شود.
پس از قرار دادن نمونه بر روی پلیت، یک حلال یا مخلوط حلال (معروف به فاز متحرک) به وسیله اثر مویرگی (Capillary action) روی پلیت کشیده می‌شود. از آن‌جایی که آنالیت‌های (Analyte) مختلف با سرعت‌های متفاوت در پلیت TLC بالا می‌روند، با این امر جداسازی حاصل می‌شود.
بنابراین بر اساس اصل کروماتوگرافی جذب سطحی (Adsorption chromatography) یا کروماتوگرافی تقسیمی (Partition chromatography) یا ترکیبی از هر دو، بسته به جاذب، تاثیر آن و ماهیت حلال‌ها به کار گیری می‌شود. اجزایی که کشش بیشتری به فاز ساکن دارند، کندتر حرکت می‌کنند و اجزایی که کشش کمتری نسبت به فاز ساکن دارند، سریع‌تر حرکت می‌کنند.
هنگامی که جداسازی اتفاق می‌افتد، اجزای منفرد به صورت ذره‌هایی در سطح حرکتی مربوطه روی پلیت آشکار می‌شوند. ماهیت یا خاصیت آن‌ها با استفاده از تکنیک‌های تشخیص مناسب شناسایی می‌شود.

اجزای کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

اجزای سیستم TLC شامل موارد زیر است:

پلیت‌های TLC، ترجیحاً آماده شده با یک فاز ساکن: این پلیت‌ها پایدار و از نظر شیمیایی خنثی هستند که در آن یک لایه نازک از فاز ساکن بر روی کل لایه سطحی آن اعمال می‌شود. فاز ساکن روی پلیت‌ها دارای ضخامت یکنواخت و با اندازه ذرات ریز است.
محفظه TLC: برای تکمیل فرایند پلیت TLC استفاده می‌شود. محفظه یک محیط یکنواخت در داخل برای رشد مناسب ذره‌ها را ایجاد و حفظ می‌کند. همچنین از تبخیر حلال‌ها جلوگیری و فرآیند را بدون گرد و غبار نگه می‌دارد.
فاز متحرک: این فاز شامل یک حلال یا مخلوط حلال است. فاز متحرک مورد استفاده باید بدون ذرات و دارای بالاترین درجه خلوص باشد تا به درستی ذرات TLC ایجاد شوند. حلال‌های توصیه شده از نظر شیمیایی نسبت به نمونه (یک فاز ساکن) خنثی هستند.
یک کاغذ صافی: این کاغذ در فاز متحرک مرطوب می‌شود تا در داخل محفظه قرار گیرد. این امر به ایجاد یک افزایش یکنواخت در فاز متحرک در طول فاز ساکن کمک می‌کند.

پروسه کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

فاز ساکن به طور یکنواخت روی پلیت اعمال می‌شود و سپس اجازه داده می‌شود تا خشک و تثبیت شود. با این وجود امروزه از پلیت‌های آماده، بیشتر استفاده می‌شود.

با مداد، یک علامت نازک در پایین پلیت ایجاد شده تا برای ذرات نمونه استفاده شود.
سپس محلول‌های نمونه بر روی ذرات مشخص شده روی خط در فواصل مساوی استفاده می‌شوند.
فاز متحرک در داخل محفظه TLC تا چند سانتی متر بالاتر از کف آن ریخته می‌شود.
یک کاغذ صافی مرطوب شده در فاز متحرک روی دیواره داخلی محفظه قرار می‌گیرد تا رطوبت متوازن را حفظ کند (و همچنین از اثر لبه (Edge effect) جلوگیری کند).
اکنون پلیت تهیه شده با نمونه حاوی ذرات در محفظه TLC قرار داده می‌شود به طوری که کناره پلیت با خط نمونه در تماس با فاز متحرک باشد. سپس محفظه با یک درب بسته می‌شود.
سپس پلیت غوطه‌ور می‌شود، به طوری که ذرات نمونه به خوبی بالاتر از سطح فاز متحرک (اما در حلال غوطه‌ور نمی‌شوند) برای تکامل فرایند باشند.
زمان کافی برای ایجاد ذره‌ها داده می‌شود.
سپس پلیت‌ها برداشته شده و اجازه داده می‌شود تا خشک شوند.
سپس ذرات نمونه در یک محفظه نور ماوراء بنفش مناسب یا هر روش دیگری که برای نمونه داده شده توصیه شده، مشاهده می‌شوند.

برخی از تکنیک‌های رایج برای تصویرسازی نتایج یک پلیت TLC عبارتند از:

نور فرابنفش
رنگ‌آمیزی ید (Iodine Staining): در شناسایی کربوهیدرات‌ها بسیار مفید است زیرا در تماس با ید، سیاه می‌شود.
رنگ‌آمیزی KMnO4 (مولکول‌های آلی)
شناساگر نین‌هیدرین (Ninhydrin): اغلب برای شناسایی اسیدهای آمینه و پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

مقدار ضریب بازداری (Retention Factor (Rf ))

رفتار یک ترکیب در یک TLC معمولاً بر اساس تحرک نسبی یا مقدار Rf توصیف می‌شود.
Rf یا ضریب بازداری یک مقدار منحصر به فرد برای هر ترکیب در شرایط یکسان است.
Rf برای یک ترکیب از یک آزمایش به آزمایش بعدی ثابت است تنها در صورتی که شرایط کروماتوگرافی زیر نیز ثابت باشند:
سیستم حلال
جاذب
ضخامت جاذب
میزان مواد حاوی ذرات
درجه حرارت
از آن‌جایی که ثابت نگه داشتن این عوامل از آزمایشی به آزمایش دیگر دشوار است، به طور کلی مقادیر Rf نسبی در نظر گرفته می‌شوند.
Rf نسبی به این معنی است که مقادیر نسبت به یک استاندارد گزارش می‌شوند.
مقدار Rf با استفاده از رابطه زیر محاسبه می‌شود:

کاربردهای کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

در نظارت بر پیشرفت واکنش‌ها
شناسایی ترکیبات موجود در یک مخلوط معین
تعیین درجه خلوص یک ماده
آنالیز سرامیدها (Ceramide) و اسیدهای چرب (Fatty acid)
شناسایی آفت کش‌ها یا حشره کش‌ها در غذا و آب
آنالیز ترکیب رنگ فیبرها (Fiber) در پزشکی قانونی
سنجش خلوص رادیوشیمیایی رادیوداروها
شناسایی گیاهان دارویی و ترکیبات آن‌ها

مزایای کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

این کروماتوگرافی یک فرآیند ساده با زمان تکمیل کوتاه است.
به تصویری‌سازی ذرات ترکیب جدا شده به راحتی کمک می‌کند.
به جداسازی بیشتر ترکیبات کمک می‌کند.
فرآیند جداسازی سریع‌تر و گزینش پذیری برای ترکیبات بیشتر است (حتی تفاوت‌های کوچک در خواص شیمیایی برای جداسازی واضح، کافی است).
استانداردهای خلوص نمونه داده شده را می‌توان به راحتی ارزیابی کرد.
این فرایند یک تکنیک کروماتوگرافی ارزان‌تر است.

محدودیت‌های کروماتوگرافی لایه نازک (TLC)

نمی‌تواند تفاوت بین انانتیومرها (Enantiomer) و برخی ایزومرها (Isomer) را تشخیص دهد.
به منظور شناسایی ترکیبات خاص، مقادیر Rf برای ترکیبات مورد نظر باید از قبل شناخته شده باشد.
پلیت‌های TLC فاز ثابت طولانی ندارند. بنابراین، مدت زمان جداسازی در مقایسه با سایر تکنیک‌های کروماتوگرافی محدود است.

مطالب مرتبط با کروماتوگرافی لایه نازک:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه