کروماتوگرافی میل ترکیبی: تعریف، اصول، اجزا، مراحل و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

کروماتوگرافی میل ترکیبی چیست؟

کروماتوگرافی یک تکنیک بیوفیزیکی مهم است که جداسازی، شناسایی و خالص‌سازی اجزای یک مخلوط را جهت آنالیز کمی و کیفی، ممکن می‌سازد.
این روش یک تکنیک جداسازی است که در آن یک فاز متحرک (Mobile phase) حامل یک مخلوط در تماس با یک فاز ساکن (Stationary phase) جاذب انتخابی، باعث حرکت می‌شود.
کروماتوگرافی میل ترکیبی نوعی کروماتوگرافی مایع برای جداسازی، خالص‌سازی یا آنالیز اختصاصی اجزای نمونه است.
این روش از برهم‌کنش بیولوژیکی برگشت‌پذیر یا تشخیص مولکولی که میل ترکیبی (Affinity) نامیده می‌شود، استفاده می‌کند و به نیروی جذبی اعمال شده در درجات مختلف بین اتم‌ها اشاره دارد که باعث می‌شود آن‌ها در ترکیب باقی بمانند.

مثال: آنزیم با یک مهار کننده، آنتی‌ژن با یک آنتی‌بادی و غیره.

کروماتوگرافی میل ترکیبی توسط Pedro Cuatrecasas و Meir Wilcheck کشف شد.

اصول کروماتوگرافی میل ترکیبی

فاز ساکن از یک محیط بستر تشکیل شده است که سوبسترا (لیگاند (Ligand)) به صورت کووالانسی به آن متصل می‌شود، به گونه‌ای که گروه‌های واکنشی که برای اتصال مولکول هدف ضروری هستند، در معرض آن قرار می‌گیرند.
زمانی که مخلوط ابتدایی مواد از ستون کروماتوگرافی عبور می‌کند، مواد دارای محل اتصال برای بستر تثبیت‌شده، به فاز ساکن متصل می‌شوند، در حالی که تمام مواد دیگر در ظرفیت خالی ستون شسته می‌شوند.
هنگامی که مواد دیگر شسته می‌شوند، مولکول‌های هدف متصل را می‌توان با روش‌هایی مانند روش‌های شامل یک لیگاند رقابتی در فاز متحرک یا تغییر pH، قدرت یونی (Ionic strength) یا شرایط قطبیت شستشو داد.

اجزای کروماتوگرافی میل ترکیبی

ماتریس

ماتریس یک بستر بی‌اثر است که لیگاند را می‌توان به طور مستقیم یا غیرمستقیم به آن متصل کرد.
برای اینکه ماتریس موثر باشد باید دارای خصوصیات خاصی باشد:
ماتریس باید از نظر شیمیایی و فیزیکی بی‌اثر باشد.
باید در حلال‌ها و بافرهای به کار رفته در این فرآیند، غیر قابل حل باشد
باید از نظر شیمیایی و مکانیکی پایدار باشد.
باید به راحتی به یک لیگاند یا یک شاخه فاصله‌دهنده (Spacer arm) که لیگاند را می‌توان به آن وصل کرد، متصل شود.
باید خواص جریان خوبی از خود نشان دهد و سطح نسبتاً زیادی برای اتصال داشته باشد.
مفیدترین مواد ماتریکس، آگارز (Agarose) و پلی‌آکریل‌آمید (Polyacrylamide) هستند.

شاخه فاصله‌دهنده

از این شاخه برای بهبود اتصال بین لیگاند و مولکول هدف به وسیله غلبه بر هر گونه اثر ممانعت فضایی (Steric hindrance)، استفاده می‌شود.

لیگاند

به مولکولی اطلاق می‌شود که به طور برگشت‌پذیر به یک مولکول هدف خاص متصل می‌شود.
لیگاند را تنها پس از مشخص شدن ماهیت ماکرومولکولی (Macromolecule) که باید جداسازی شود، می‌توان انتخاب کرد.
هنگامی که یک پروتئین گیرنده هورمونی قرار است به وسیله کروماتوگرافی بر اساس میل ترکیبی خالص شود، خود هورمون کاندیدایی ایده‌آل برای لیگاند است.
برای جداسازی آنتی‌بادی، ممکن است از یک آنتی‌ژن یا هاپتن (Hapten) به عنوان لیگاند استفاده شود.
اگر قرار است آنزیمی خالص شود، می‌توان از آنالوگ سوبسترا (Substrate analog)، مهارکننده، کوفاکتور (Cofactor) یا افکتور (Effector) به عنوان لیگاند تثبیت‌شده، استفاده کرد.

مراحل کروماتوگرافی میل ترکیبی

محیط میل ترکیبی در بافر اتصال موازنه می‌شود.
نمونه تحت شرایطی استفاده می‌شود که اتصال خاص مولکول(های) هدف به یک ماده اتصال مکمل (لیگاند) را تسهیل می‌کنند. مواد هدف به طور خاص، اما برگشت‌پذیر، به لیگاند متصل می‌شوند و مواد غیر متصل از طریق ستون شسته می‌شوند.
شستشو به طور خاص با استفاده از یک لیگاند رقابتی، یا به طور غیر اختصاصی با تغییر pH، قدرت یونی یا قطبیت انجام می‌شود. پروتئین هدف به شکل خالص و غلیظ جمع می‌شود.
محیط میل ترکیبی با بافر اتصال مجدداً موازنه می‌شود.

این رویدادها را می‌توان در سه مرحله اصلی زیر خلاصه کرد:

آماده‌سازی ستون

ستون با یک بستر جامد مانند سفاروز (Sepharose)، آگارز، سلولز (Cellulose) و غیره بارگذاری می‌شود.
لیگاند با توجه به ایزوله مورد نظر انتخاب می‌شود.
شاخه فاصله‌دهنده به فضای بین لیگاند و بستر جامد متصل می‌شود.

بارگذاری نمونه

محلول حاوی مخلوطی از مواد در ستون شستشو ریخته شده و اجازه داده می‌شود تا عمل شستشو با سرعت کنترل شده، اجرا شود.

شستشوی کمپلکس لیگاند- مولکول

ماده هدف با تغییر شرایط جهت تسهیل شستشوی مولکول‌های متصل، بازیابی می‌شود.

کاربردهای کروماتوگرافی میل ترکیبی

کروماتوگرافی میل ترکیبی یکی از مفیدترین روش‌ها برای جداسازی و خالص‌سازی محصولات خاص است.

این روش در اصل یک تکنیک خالص‌سازی نمونه است که عمدتاً برای جداسازی و خالص‌سازی مولکول‌های بیولوژیکی مانند پروتئین‌ها استفاده می‌شود.

کاربردهای عمده آن شامل موارد ذیل می‌شود:

جداسازی مخلوطی از ترکیبات.
حذف ناخالصی‌ها یا در فرآیند خالص‌سازی.
در سنجش آنزیمی.
شناسایی بسترها.
بررسی محل اتصال آنزیم‌ها.
در بررسی واکنش‌های آنتی‌ژن- آنتی‌بادی به طور آزمایشگاهی.
شناسایی پلی‌مورفیسم‌ها (Polymorphism) و جهش‌های تک نوکئوتیدی (Nuceotide) در اسیدهای نوکلئیک (Nucleic acid).

مزایای کروماتوگرافی میل ترکیبی

اختصاصیت بالا.
مولکول‌های هدف را می‌توان در حالت بسیار خالص به دست آورد.
خالص‌سازی تک مرحله‌ای.
ماتریس را می‌توان به سرعت مورد استفاده مجدد قرار داد.
ماتریس جامد بوده، به راحتی قابل شستشو و خشک کردن است.
محصول خالص شده با بازده بالا ارائه می‌دهد.
همچنین می‌توان از کروماتوگرافی بر اساس میل ترکیبی برای حذف آلاینده‌های خاص مانند پروتئازها (Protease) استفاده کرد.

محدودیت‌های کروماتوگرافی میل ترکیبی

روشی وقت‌گیر است.
به مقادیر بیشتری از حلال نیاز دارد که ممکن است گران باشد.
به کار زیاد نیاز دارد.
جذب غیر اختصاصی را نمی‌توان به طور کامل حذف کرد، فقط می‌توان آن را به حداقل رساند.
به طور محدود در دسترس بوده و لیگاندهای تثبیت شده هزینه بالایی دارند.
اگر PH مورد نیاز تنظیم نشود، پروتئین‌ها دناتوره (Denatured) می‌شوند.

همچنین بخوانید: