تست اصلاح شده هاج یا تست MHT: اصول، روش، نتایج و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر تست MHT

تست اصلاح شده هاج یک روش فنوتیپی (Phenotypic) برای تشخیص تولید کارباپنماز (Carbapenemase) توسط پاتوژن‌های ایزوله شده در آزمایشگاه‌های بالینی می‌باشد. این تست یک روش قابل اعتماد برای تأیید این موضوع است که مقاومت نسبت به کارباپنم (Carbapenem) در پاتوژن باکتریایی ایزوله شده با تولید کارباپنماز مرتبط است.

تست اصلاح شده هاج در ابتدا برای شناسایی کارباپنماز در انتروباکتریاسه (Enterobacteriaceae) جهت اهداف اپیدمیولوژیک یا بالینی استفاده می‌شد. اما در ادامه از این تست برای شناسایی کارباپنماز در سایر باکتری‌های گرم منفی مشکوک نیز استفاده شد.

با این حال از سال 2018، موسسه استاندارد بالینی و آزمایشگاهی (Clinical and Laboratory Standard Institute (CLSI)) این تست را به عنوان یک “روش فنوتیپی که دیگر برای غربالگری کارباپنماز قابل اطمینان نیست” معرفی و استفاده از تست‌های دیگری مانند تست CarbaNP و تست mCIM را توصیه کرده است.

نیازمندی‌های این تست به راحتی و با نرخ کمتری نسبت به سایر تست‌ها قابل دسترسی است. از این رو چندین آزمایشگاه بالینی کوچک (بیشتر در کشورهای در حال توسعه) هنوز از این تست به عنوان یک روش فنوتیپی برای شناسایی آنزیم‌های کارباپنماز استفاده می‌کنند.

اهداف تست اصلاح شده هاج

برای تشخیص تولید کارباپنماز.

برای تشخیص این‌که آیا مقاومت نسبت به کارباپنم به دلیل تولید کارباپنماز است یا مکانیسم‌های دیگر.

اصول تست MHT

این تست بر این اصل استوار است که آنزیم کارباپنماز تولید شده توسط ارگانیسم مورد آزمایش، آنتی‌بیوتیک کارباپنم را هیدرولیز کرده و در نتیجه میزان رشد باکتری‌های E. coli حساس به کارباپنم را افزایش می‌دهد.

اگر ارگانیسم مورد آزمایش، هر گونه آنزیم کارباپنمازی تولید کند، این آنزیم آنتی‌بیوتیک پخش شده در محیط را در مجاورت خطوط کشت رگه‌ای هیدرولیز می‌کند. این امر باعث افزایش رشد E. coli می‎شود و در غیر این صورت (عدم هیدرولیز آنتی‌بیوتیک)، ارگانیسم توسط آنتی‌بیوتیک در مجاورت خطوط تلقیح مهار می‌‌شود.

این افزایش رشد منجر به این می‌شود که E. coli و یا ارگانیسم آزمایشی در ناحیه مهار به صورت برجسته رشد و یک الگوی برگ شبدر مانند ایجاد کنند.

نیازمندی‌های تست MHT

coli حساس به کارباپنم (سویه E. coli ATCC 25922)
پلیت‎های مولر هینتون آگار (Mueller Hinton Agar (MHA)).
باکتری آزمایشی
باکتری کنترل:

کنترل مثبت: کلبسیلا پنومونیه ATCC BAA – 1705 : MHT مثبت

کنترل منفی: کلبسیلا پنومونیه ATCC BAA – 1706: MHT منفی

دیسک آنتی‌بیوتیک کارباپنم (10 میکروگرم اتراپنم (Etrapenem) یا دیسک مروپنم (Meropenem))
سواب پنبه‌ای یا میله شیشه‌ای خم شده (Dolly rod) و لوپ تلقیح
سایر تجهیزات عمومی مانند چراغ بونزن (Bunsen burner)، سالین واتر استریل (یا براث)، استانداردهای مک‌فارلند 0.5، فورسپس (Forceps)، اسپریت (Spirit) و غیره.

روش تست اصلاح شده هاج (MHT)

یک سوسپانسیون استاندارد مک‌فارلند 5 از E. coli ATCC 25922 (یا سویه E. coli حساس به کارباپنم) تهیه کنید.
سوسپانسیون را با سالین استریل یا براث به نسبت 1 از 10 رقیق کنید (0.5 میلی‌لیتر سوسپانسیون را به 4.5 میلی‌لیتر سالین یا براث اضافه کنید).
سوسپانسیون coli رقیق شده را به طور یکنواخت روی یک پلیت MHA استریل (همانند تست حساسیت ضد میکروبی معمول) رگه بزنید یا پخش کنید و اجازه دهید حدود 3 تا 10 دقیقه بماند تا خشک شود.
دیسک 10 میکروگرم مروپنم یا اتراپنم را در مرکز پلیت MHA تلقیح شده، قرار دهید.
[توجه: بیش از یک (1) دیسک برای یک پلیت پتری 10 سانتی‌متری توصیه نمی‌شود. و بیش از چهار (4) دیسک برای یک پلیت پتری 15 سانتی‌متری توسط CLSI توصیه نمی‌شود]
با استفاده از یک لوپ یا سواب تلقیح استریل، 3 تا 5 کلنی از ارگانیسم‌های آزمایشی تازه کشت شده را برداشته و از لبه دیسک تا لبه پلیت به صورت خطی از داخل به بیرون و در یک خط مستقیم رگه بزنید.
[توجه: بیش از یک (1) ارگانیسم آزمایشی و دو (2) سویه کنترل برای پلیت پتری 10 سانتی‌متری و بیش از شش (6) ارگانیسم آزمایشی و دو (2) سویه کنترل برای پلیت پتری 15 سانتی‌متری توسط CLSI توصیه نمی‌شود.]

[طول رگه باید حداقل 20 تا 25 میلی‌متر باشد]

پلیت را در دمای 2±35 درجه سانتی‌گراد به مدت 16 تا 24 ساعت در هوای محیط انکوبه کنید.

برسی تست MHT

پس از انکوباسیون، رشد افزایش یافته E. coli و ایجاد برجستگی‌های برگ شبدر مانند در تقاطع رگه ارگانیسم مورد آزمایش (و کنترلی‌ها در صورت استفاده) و ناحیه مهار E. coli را بررسی کنید.

تفسیر نتایج تست اصلاح شده هاج (تست MHT)

رشد افزایش یافته (تشکیل الگوی برگ شبدر مانند) = نتیجه مثبت (تولید کارباپنماز)
عدم رشد افزایش یافته (عدم تشکیل الگوی برگ شبدر مانند) = نتیجه منفی (عدم تولید کارباپنماز)

کلبسیلا پنومونیه ATCC BAA – 1705 رشد افزایش یافته E. coli را نشان می‌دهد و یک الگوی برگ شبدر مانند را تشکیل می‌دهد، در حالی که کلبسیلا پنومونیه ATCC BAA – 1706 رشد افزایش یافته E. coli را نشان نمی‌دهد.

مزایای تست MHT

اجرای آن ساده و آسان است.
به منابع گران قیمت نیاز ندارد، از این رو می‌تواند توسط آزمایشگاه‌ها و موسسات کوچک‌تر اجرا شود.

محدودیت‌ها

ارگانیسم‌هایی که آنزیم‌های بتالاکتاماز طیف گسترده (Extended-spectrum β- lactamase) (ESBLs) و آنزیم‌های β-لاکتاماز AmpC تولید می‌کنند، نتیجه مثبت کاذب می‌دهند.
برخی از ارگانیسم‌های آزمایشی، متابولیت‌هایی تولید می‌کنند که مانع از رشد coli می‌شوند.
این تست نمی‌تواند همه تولید کننده‌های کارباپنماز را تشخیص دهد، بنابراین اغلب نتایج منفی کاذب نشان می‌دهد (برخی از تحقیقات حدود 25 تا 30 درصد نتایج منفی کاذب را نشان می‌دهند).
نیاز به زمان انکوباسیون طولانی‌تری دارد.

همچنین بخوانید: