گرفتن سلول‌های لوسمی در گردش برای بررسی توسط فلوسایتومتری

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر گرفتن سلول‌های لوسمی در گردش برای بررسی توسط فلوسایتومتری

محققان روش جدیدی را برای شناسایی سلول‌های لوسمی در گردش و سایر سلول‌های با فراوانی کم توسط فلوسایتومتری ایجاد کرده‌اند. این تکنیک امکان تعیین کمیت اثر فلورسانس را فراهم می‌کند که پایه ایمونوفنوتایپ را فراهم می‌کند.

ایمونوفنوتایپینگ شناسایی سلول ها یا زیرمجموعه های سلولی توسط سطح سلولی یا نمایه نشانگر درون سلولی آنها است. این روش که فلوسایتومتری ادغام-طیفی با تاخیر زمانی نامیده می شود (TDI-SFC)، وضوح بالای فلوسایتومتری طیفی (SFC) را با یک دوربین CCD که در حالت TDI کار می کند ترکیب می کند.

محدودیت‌های فلوسایتومتری چند پارامتری

فلوسایتومتری چند پارامتری با استفاده از چندین ویژگی سلولی که شامل پیچیدگی، بیان پروتئین و اندازه است، سلول ها را مشخص می‌کند. هر یک از این ویژگی‌ها با استفاده از برچسب‌گذاری فلورسانس و به دنبال آن مرتب‌سازی طیفی ردیابی می‌شوند، از این رو اصطلاح «چند پارامتریک» برای آن استفاده می‌شود.

مرتب‌سازی سلول‌های فلوسایتومتری چند پارامتری با “گیتینگ”، جداسازی سلول‌ها بر اساس پراکندگی و همچنین نشانگرهایی که با برچسب‌گذاری فلورسانس مشخص شده‌اند، به دست می‌آید. این توانایی مرتب‌سازی به تعداد سلول بستگی دارد و برای ایجاد آستانه‌های صحیح و همچنین جلوگیری از تداخل در طول مرتب‌سازی طیفی به بیش از 10000 سلول نیاز دارد.

عدم وجود تعداد کافی سلول‌ها ، نتایج ضعیف در وضوح طیفی و نویز ایجاد شده از فلورسانس ها می‌توانند منجر به طبقه بندی اشتباه سلول‌ها شوند. میکروسکوپ فلورسانس طبقه بندی اشتباه را دور می‌زند زیرا از فلورسانس مورفولوژیکی موضعی استفاده می‌کند.

با این حال، سلول‌ها به صورت دستی شمارش می‌شوند، که به‌شدت توان بالینی را برای نمونه‌های دارای بیش از 100 سلول محدود می‌کند. اگرچه فلوسایتومترهای تصویربرداری (IFC) این مشکل را حل می‌کنند، اما گران هستند و تجزیه و تحلیل داده‌ها نیمه خودکار است و همچنان پردازش بالینی را محدود می‌کنند.

معرفی فلوسایتومتری ادغام – طیفی با تاخیر زمانی (TDI-SFC)

راه حلی برای این مشکل منحصر به فرد توسط Hu و همکارانش به شکل SFC ارائه شده است. این نسخه از فلوسایتومتری تجزیه و تحلیل 100-10000 سلول در نمونه را امکان پذیر می‌کند در ترکیب با TDI، نسبت زمانی که سیستم در طی آن کار می کند (چرخه وظیفه) و حساسیت هر دو بهبود می‌یابند.

دوربین‌های CCD فوتون‌های تابشی را به شارژ عکس تبدیل می‌کنند که مجموعه‌ای از پیکسل‌ها را تشکیل می‌دهند. در TDI، شارژهای عکس از یک پیکسل به پیکسل دیگر به سمت پایین منتقل می‌شوند، همزمان با جهت و سرعت حرکت سلول در جریان، به سیگنال شارژ نور اجازه داده می‌شود تا در بسیاری از پیکسل‌ها پخش شود.

این افکت مشابه پنینگ دوربین است و از تاری تصویر جلوگیری می کند و به آن یکپارچه سازی سیگنال گفته می‌شود. استفاده از ذرات فلورسنت هماهنگ سازی TDI با سرعت سلول را بهینه می‌کند. به طور کلی این سه مزیت متمایز را ارائه می‌دهد:

نسبت سیگنال به نویز با فاکتور N، هنگامی که سیگنال روی ردیف N یکپارچه می شود و در مقایسه با بازخوانی‌های استاندارد فول فریم زمانی، بهبود می‌یابد
هنگامی که سلول‌ها از میدان دوربین CCD خارج می‌شوند، طیف انتشار یکپارچه برای بازخوانی ارسال می‌شود. به این ترتیب شاتر هرگز بسته نمی‌شود. این به ویژه زمانی مشکل ساز است که تعداد کل سلول های موجود با تعداد موجود در نمونه (<10000) محدود شود زیرا سلول‌ها می توانند از تشخیص CCD فرار کنند
سلول های متعدد را می توان مورد بررسی قرار داد

استفاده از قدرت TDI-SFC

TDI-SFC ساده است و قادر به ترکیب چندین سیگنال در چیزی است که به آن “مالتی پلکس” می‌گویند و به خوبی به نمونه برداری بالینی از سلول‌های با حجم بالا و فراوانی کم مانند سلول‌های لوسمی در گردش و سلول‌های تومور در گردش کمک می‌کند. محققان ایمونوتایپینگ سلول لوسمی در گردش را به عنوان یک برنامه اثبات مفهوم ارائه کردند.

ایمونوتایپینگ سلول‌های لوسمی در گردش به ویژه در مواردی که بیماران در حال بهبودی هستند مرتبط است – سلول‌های لوسمی در گردش ممکن است مقاومت دارویی ایجاد کنند که می‌تواند به سطوح کشنده بیماری تبدیل شود. میکروسکوپ فلورسانس سنتی و تجزیه و تحلیل مبتنی بر فلوسایتومتری چند پارامتری قبلاً به دلیل نویز پس‌زمینه ناشی از سلول‌های خونی و فراوانی کم سلول‌های لوسمی در گردش موفق نبوده است.

TDI-MFC می‌تواند شامل یک مرتب‌کننده جریان برای جمع‌آوری سلول‌های لوسمی در گردش ایمونونوتیپ شده باشد که از تشریح لیزری یا برداشت تک سلولی برای بازیابی سلول‌های لوسمی در گردش لازم هنگام مرتب‌سازی آنها از طریق میکروسکوپ جلوگیری می‌کند. هو و همکاران کاربرد TD-SFC را برای یک رده سلولی B-ALL رنگ آمیزی شده با رنگ هسته ای و نشانگر لوسمیک (anti-TdT-FITC) نشان داد.

100% سلول ها با خواندن طیف با سیگنال های بالا به طور دقیق طبقه بندی شدند. نسبت سیگنال به نویز تولید شده توسط TDI به تنهایی توسط SFC تغییر یافته و منجر به شناسایی حتی با تعداد سلول های کم (46-111 سلول) شد. حساسیت فلورسانس با شدت تحریک، دیافراگم عددی epi-illumination و زمان ادغام بهبود یافت.

با این حال، نویسندگان برخی محدودیت‌ها را در مورد این سیستم TDI ذکر می‌کنند. توان عملیاتی توسط نرخ بازخوانی CCD و ضریب تغییرات محدود می شود که دقت و تکرارپذیری را به طور قابل توجهی بالاتر (27.8٪) نسبت به فلوسایتومتری چند پارامتری (6.1٪) اندازه گیری می‌کند.

نویسندگان حدس می‌زنند که استفاده از فوکوس میکروسیالی دو بعدی به جای یک بعدی به سلول‌ها اجازه می‌دهد تا به‌طور تکراری متمرکز شوند تا سلول‌ها را به صورت جانبی تراز کنند و متعاقباً ضریب تغییرات را کاهش دهند.

نویسندگان امیدوارند که به دنبال بهینه سازی بیشتر TDI-SFC، به طور بالقوه بتواند در هر برنامه ای که نیاز به ایمونوفنوتایپینگ سلول های کم فراوانی داشته باشد، مانند پایش بیماری باقیمانده قابل اندازه گیری در لوسمی های حاد به دنبال غنی سازی میل ترکیبی سلول های لوسمی در گردش از خون محیطی استفاده شود.

همچنین بخوانید: