کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون: نحوه کار، انواع، قطعات، کاربرد

مولکول‌های زیستی با استفاده از تکنیک‌های مختلف جدا‌سازی و خالص می‌شوند که آنها را با توجه به تفاوت‌ در ویژگی‌های خاص مانند اندازه، آبگریز بودن، ویژگی زیستی، بار و غیره جدا می‌کنند.

کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون تکنیکی است که در آن جداسازی اجزا بر اساس تفاوت در وزن مولکولی یا اندازه است که ساده‌ترین روش کروماتوگرافی است و مولکولها را بر اساس تفاوت در اندازه جدا می‌کند.

نحوه کار کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

برای انجام جداسازی، محیط ژل فیلتراسیون در ستونی قرار می‌گیرد تا بستر ایجاد شود. محیط ژل فیلتراسیون به صورت بستری متخلخل با ذرات کروی است که به دلیل پایداری شیمیایی و فیزیکی و بی اثر بودن (عدم واکنش پذیری و خاصیت جذب) انتخاب شده است. نوعی بافر نیز در بستر قرار میگیرد که منافذ و فضای بین ذرات را پر می‌کند. گاهی مایع درون منافذ به عنوان فاز ثابت درنظر گرفته می‌شود و این مایع با مایع خارج از ذرات که به آن فاز متحرک می‌گویند، در حالت تعادل است.

• فاز ثابت یک بستر پلیمری متخلخل است که منافذ آن با حلال پر شده تا به عنوان فاز متحرک مورد استفاده قرار گیرد.
• مولکول‌های نمونه از میان ستون‌های اختصاصی با منافذ کوچک و متخلخل (ژل) پمپ می‌شوند.
• اساس کار این نوع کروماتوگرافی برای جداسازی به این صورت است که مولکول‌های بزرگتر از اندازه‌ی مشخص شده، به طور کامل از منافذ حذف می‌شوند، در حالی که مولکول‌های کوچکتر از منافذ عبور می‌کنند.

جریان فاز متحرک، مانع ورود مولکول‌های بزرگتر به ستون می‌شود، در حالی که مولکول‌های کوچکتر را از ژل عبور می‌دهد.

انواع کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

جداسازی گروهی

• اجزای یک نمونه با توجه به محدوده اندازه به دو گروه عمده تقسیم می‌شوند.
• جداسازی گروهی را می‌توان برای حذف آلودگی‌های با وزن مولکولی بالا یا پایین (مانند فنل قرمز از کشت مایعات) یا نمک زدایی و تبادل بافرها استفاده کرد.

جداسازی مولکول‌های زیستی با قدرت تفکیک بالا

• اجزای یک نمونه با توجه به تفاوتشان در اندازه مولکولی از هم جدا می‌شوند.
• جداسازی با قدرت تفکیک بالا، برای جدا کردن یک یا چند جزء، جدا کردن مونومرها از یک نمونه، تعیین وزن مولکولی یا انجام آنالیز توزیع وزن مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

1. ذرات کروی محیط ژل فیلتراسیون در ستون قرار می‌گیرند.
2. نمونه روی ستون قرار می‌گیرد.
3. بافر (فاز متحرک) و نمونه در ستون حرکت می‌کنند.
4. مولکول‌ها در داخل و خارج از منافذ بستر، منتشر می‌شوند (نمونه بین فاز متحرک و فاز ثابت قرار می‌گیرد).
5. مولکول‌های کوچکتر درون بستر حرکت می‌کنند و بنابراین مدت بیشتری نسبت به مولکولهای بزرگتر، روی ستون باقی می‌مانند.
6. همانطور که بافر به طور مداوم از میان ستون عبور می‌کند، مولکول‌هایی که بزرگتر از منافذ بستر هستند، قادر به انتشار در منافذ و عبور از ستون نیستند.
7. مولکول‌های کوچکتر در منافذ پخش می‌شوند و برای عبور از ستون نیاز به زمان بیشتری دارند.
8. جداسازی در بازه‌های زمانی مختلف انجام می‌شود تا اجزاء کاملا تفکیک شوند.

کاربردهای کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

• ژل فیلتراسیون نقش مهمی در خالص سازی آنزیم‌ها، پلی ساکاریدها، اسیدهای نوکلئیک، پروتئینها و سایر ماکرومولکولهای بیولوژیکی دارد.
• ژل فیلتراسیون همچنین می‌تواند برای تسهیل پیچ خوردگی مجدد پروتئینهای دناتوره، استفاده شود که با کنترل دقیق شرایط بافر انجام می‌شود.
• در آزمایشات جداسازی پروتئین استفاده می‌شود.
• تکنیک ژل فیلتراسیون در تعیین وزن مولکولی نیز استفاده می‌شود.
• در جداسازی قند، پروتئین، پپتید، ترکیبات الاستیک و غیره بر اساس اندازه، مورد استفاده قرار میگیرد.
• می‌توان برای تعیین ساختار چهارم پروتئینهای خالص شده، از کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون استفاده کرد.

مزایای کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

• ژل فیلتراسیون یک تکنیک قوی است که برای دست ورزی بیومولکول‌هایی که به تغییرات pH، غلظت یون‌های فلزی یا عوامل و شرایط خاص حساس هستند، مناسب است.
• مزیت قابل توجه ژل فیلتراسیون این است که شرایط را می‌توان متناسب با نوع نمونه یا الزامات خالص سازی، تغییر داد.
• عملیات جداسازی را می‌توان در حضور یون یا کوفاکتورهای ضروری، مواد شوینده، اوره، گوانیدین هیدروکلراید، با قدرت یونی بالا یا پایین، در دمای 37 درجه سانتی گراد یا در اتاق سرد با توجه به الزامات آزمایش انجام داد.
• برخلاف کروماتوگرافی تعویض یونی یا کروماتوگرافی میل ترکیبی، مولکول‌ها به محیط کروماتوگرافی متصل نمی‌شوند بنابراین ترکیب بافر مستقیماً بر تفکیک (درجه جدایی بین پیک ها) تأثیر نمی‌گذارد.
• زمان کوتاه تفکیک.
• تفکیک به خوبی انجام می‌شود.
• ایجاد نوارهای باریک و دارای حساسیت مناسب.
• بدون تخریب نمونه.
• مقدار کمی فاز متحرک مورد نیاز است.
• شدت جریان را می‌توان تنظیم کرد.

محدودیت‌های کروماتوگرافی ژل فیلتراسیون

• تعدادی از پیک‌ها در مقیاس زمانی کوتاه حین جداسازی، حل می‌شوند.
• قبل از استفاده باید فیلترها اعمال شوند تا از خراب شدن ستون‌ها و تداخل گرد و غبار و ذرات دیگر با آشکارسازها جلوگیری شود.
• جرم مولکولی بیشتر زنجیره‌ها بسیار نزدیک به هم هستند و پیک‌ها را نمی‌توانند به خوبی نشان دهند.

همچنین بخوانید:

• کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا (HPLC) چیست؟
• کروماتوگرافی چیست؟

مترجم: معصومه قریبی ششده

 منبع