تعریف تست بیال
تست بیال یک آزمایش شیمیایی است که برای تشخیص وجود پنتوز (Pentose) و پنتوزان ((pentosan) مشتقات پنتوزها) انجام می‌شود. اشتقاقی از این تست به نام Bial’s Orchintest برای تشخیص حضور RNA در محلول‌ها انجام می‌شود.
اهداف تست بیال
- برای تشخیص وجود کربوهیدرات‌ها.
- برای افتراق پنتوزها و پنتوزان‌ها از سایر مشتقات کربوهیدرات‌ها مانند هگزوزها (Hexose).
اصول تست بیال
این تست بر این اصل استوار است که پنتوزان‌ها تحت هیدرولیز به پنتوز هیدرولیز می‌شوند. علاوه بر این، پنتوزها برای تولید فورفورال دهیتراته می‌شوند، که به نوبه خود با اورسینول (Orcinol) ترکیب شده و یک رسوب سبز-آبی تشکیل می‌دهند. در حضور هگزوزها، به جای فورفورال، هیدروکسی‌فورفورال (Hydroxyfurfural) تشکیل می‌شود که پس از ترکیب شدن با اورسینول، رسوبی به رنگ قهوه‌ای کدر تشکیل می‌دهد.
شدت رسوب با غلظت پنتوزها در نمونه نسبت مستقیم دارد. شدت رنگ ایجاد شده به غلظت هیدروکلراید، کلرید آهن، اورسینول و مدت زمان جوش بستگی دارد. غلظت قندها با اندازه‌گیری جذب نوری طول موج 620 نانومتر در اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) یا در رنگ سنج فیلتر قرمز تعیین می‌شود.
واکنش
نیازمندی‌ها
مواد و تجهیزات مورد نیاز
تجهیزات:
- اسپکتروفتومتر UV
- میکسر ورتکس (Vortex)
- شوف بالن (Mantle heater) یا بن‌ماری (Water bath)
مواد شیمیایی / شناساگر:
- شناساگر بیال
- قند ریبوز (Ribose)
- کربوهیدرات‌های دیگر در صورت تمایل
- نمونه
ظروف شیشه‌ای و سایر تجهیزات:
- لوله آزمایش، پایه لوله آزمایش، پیپت (Pipette)، بشر، درپوش لوله آزمایش، دستمال کاغذی، بطری شستشو.
شناساگرها
- شناساگر Bial: 300 میلی‌گرم اورسینول در 5 میلی‌لیتر اتانول حل شده است. 3.5 میلی‌لیتر از این مخلوط به 100 میلی‌لیتر محلول 0.1 درصد 6H2O اضافه می‌شود. شناساگر تشکیل شده باید در یک بطری تیره نگه‌داری و ظرف چند ساعت استفاده شود.
- محلول ذخیره ریبوز: 200 میکروگرم ریبوز در هر میلی‌لیتر آب مقطر حل می‌شود. محلول ذخیره ریبوز باید از این محلول ذخیره شده، تهیه شود. توجه: در صورت تمایل می‌توان از کربوهیدرات‌های دیگر با همان غلظت به عنوان نمونه استفاده کرد. در صورت استفاده از RNA، 300 میکروگرم بر میلی‌لیتر از محلول ذخیره RNA به بافر Tris-EDTA اضافه می‌شود.
روش تست بیال
- حجم‌های مختلف محلول ریبوز (50 میکرولیتر، 100 میکرولیتر و غیره) را از محلول ذخیره تهیه شده (200 میکروگرم بر میلی‌لیتر) با پیپت در یک سری از لوله‌های آزمایش بریزید و حجم هر کدام را با آب مقطر به 1 میلی‌لیتر برسانید.
- برای ساخت یک منحنی استاندارد، لوله‌ای را با لیبل یک به عنوان لوله خالی حاوی 1 میلی‌لیتر آب مقطر برچسب بزنید و بقیه لوله‌ها را با شماره‌های 2 تا 9 برچسب بزنید. لوله‌های 10 تا 15 هم برای نمونه‌های ناشناخته هستند.
- 5 میلی‌لیتر از شناساگر بیال را به هر لوله اضافه کرده و با ورتکس خوب مخلوط کنید.
- لوله‌ها را خنک کنید.
- روی لوله‌ها را با درپوش بپوشانید و در دمای 90 درجه سانتی‌گراد به مدت 17 دقیقه انکوبه کنید یا در بن‌ماری به مدت 10 دقیقه بجوشانید.
- لوله‌ها را تا دمای اتاق خنک کنید و چگالی نوری محلول‌ها را در طول موج 620 نانومتر در مقابل لوله خالی اندازه‌گیری کنید.
- یک منحنی استاندارد جذب در برابر غلظت ریبوز تهیه کنید.
- مقدار ریبوز را در نمونه ناشناخته با رسم منحنی استاندارد A620 در محور Y و غلظت ریبوز در محور X تعیین کنید.
نتیجه و تفسیر تست بیال
- وجود کمپلکس سبز-آبی نشان‌دهنده وجود پنتوز در نمونه است.
- با استفاده از نمودار می‌توان غلظت قند ریبوز در نمونه را تعیین کرد. تفسیر مشابهی را می‌توان برای شناسایی RNA نیز انجام داد.
موارد استفاده از تست بیال
- این تست برای تشخیص وجود پنتوز و پنتوزان در نمونه‌های مختلف استفاده می‌شود.
- این تست همچنین می‌تواند برای تعیین کمیت RNA در یک نمونه استفاده شود.
محدودیت‌های تست بیال
- در حرارت طولانی مدت، گلوکرونات (Glucoronate) نیز ممکن است رسوب آبی-سبز ایجاد کند که منجر به ایجاد نتایج مثبت کاذب می‌شود.
- رنگ تولید شده ممکن است با قندهای مختلف متفاوت باشد و غلظت ممکن است متناسب با شدت رسوب در سطوح بالاتر نباشد.
مطالب مرتبط:
- تست اوزازون (Osazone Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
- تست کاهش سولفور (Sulphur Reduction Test): اصول، روش، موارد استفاده و تفسیر
- تست ساکاگوچی (Sakaguchi Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
- تست تالنز (Tollen’s Test): تعریف، اصول، روش، نتایج و موارد استفاده
مترجم: صادق حسینی‌کیا
