تکنیک SDS-PAGE در محیط IN SILICO به منظور طراحی دارو

مقدمه‌ای بر تکنیک SDS-PAGE در محیط IN SILICO

چرا به پروتئین های نوترکیب نیاز داریم؟

پروتئین‌ها در سیستم‌های بیولوژیکی کار می‌کنند که بسیاری از فرآیندهای بیولوژیکی را در سلول تسهیل می‌کنند، از جمله بیان ژن، رشد سلولی، تکثیر، جذب مواد مغذی، ارتباطات بین سلولی و آپوپتوز. اطلاعات برای سنتز پروتئین در DNA ذخیره می شود که به عنوان الگویی برای فرآیندهای رونویسی بسیار تنظیم شده برای تولید RNA پیام رسان یا mRNA عمل می کند.

سپس پیام کد شده توسط mRNA به توالی های مشخصی از اسیدهای آمینه که یک پروتئین را تشکیل می دهند ترجمه می شود. پروتئین ها در یک فرآیند دو مرحله ای مشابه در همه موجودات سنتز می شوند. DNA ابتدا به RNA رونویسی می شود، سپس RNA به پروتئین ترجمه می شود.

پروتئین های نوترکیب چیست؟

پروتئین‌های نوترکیب پروتئین‌هایی هستند که توسط DNA نوترکیب کدگذاری شده‌اند و در یک ناقل بیانی کلون شده‌اند که از بیان ژن و ترجمه RNA پیام‌رسان پشتیبانی می‌کند. اصلاح ژن توسط فناوری DNA نوترکیب می تواند منجر به بیان یک پروتئین جهش یافته شود. پروتئین نوترکیب شکل دستکاری شده ای از پروتئین بومی است که به روش های مختلف به منظور افزایش تولید پروتئین ها، اصلاح توالی ژن ها و تولید محصولات تجاری مفید تولید می شود.

پروتئین های نوترکیب چگونه ساخته می شوند؟

تولید پروتئین نوترکیب در سطح ژنتیکی آغاز می شود، جایی که توالی کد کننده پروتئین مورد نظر ابتدا جدا شده و در یک ناقل پلاسمید بیانی کلون می شود. بیشتر پروتئین های نوترکیب برای استفاده درمانی از انسان هستند اما در میکروارگانیسم هایی مانند باکتری ها، مخمرها یا سلول های حیوانی در کشت بیان می شوند. ژن‌های انسانی بسیار پیچیده هستند و اغلب حاوی توالی‌های DNA غیر کدکننده هستند که به نام اینترون‌ها شناخته می‌شوند.

بنابراین، یک نسخه بدون اینترون از ژن اغلب با تبدیل mRNA به cDNA ساخته می شود. از آنجایی که cDNA فاقد مناطق تنظیمی است، ناقل های بیانی، پروموتر، محل اتصال به ریبوزوم و توالی های پایان دهنده را ارائه می دهند. تولید پروتئین نوترکیب برای اهداف تحقیقاتی عمدتا ناشی از مقرون به صرفه بودن، سادگی و سرعت فرآیند در ارتباط با بازده کافی محصول است. پروتئین هایی که به طور مشترک در باکتری ها بیان می شوند، دارای تغییرات پس از ترجمه نیستند، به عنوان مثال. فسفوریلاسیون یا گلیکوزیلاسیون؛ سیستم های بیان یوکاریوتی برای این مورد نیاز است.

بسیاری از پروتئین های نوترکیب نیاز به تغییرات پروتئینی مانند گلیکوزیلاسیون دارند که فقط در سلول های یوکاریوتی موجود است. سیستم های کشت سلولی مخمر، حشرات و پستانداران چنین تغییراتی را پس از ترجمه ارائه می دهند. در طول دهه گذشته، پروتکل‌های ترانسفکشن کارآمد بسیاری گزارش شده‌اند.

رده های سلولی مشتق شده از HEK293 برای تولید پروتئین ها استفاده می شود. در حال حاضر، بیشتر پروتئین‌های درمانی نوترکیب در سلول‌های پستانداران تولید می‌شوند، زیرا سلول‌های پستانداران قادر به تولید پروتئین‌های با کیفیت بالا مشابه پروتئین‌های طبیعی هستند. علاوه بر این، بسیاری از پروتئین‌های درمانی نوترکیب تایید شده در باکتری E.coli به دلیل ویژگی‌های ژنتیکی خوب، رشد سریع و تولید با بازده بالا تولید می‌شوند.

تکنیک الکتروفورز SDS-PAGE

متداول ترین فناوری مورد استفاده برای به دست آوردن جداسازی تحلیلی با وضوح بالا مخلوط پروتئین ها، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید دودسیل سولفات سدیم (SDS-PAGe) می باشد. این مرحله توسط الکتروفورز از طریق یک ماتریس ژل آکریل آمید متخلخل که پروتئین ها را با وضوح عالی بر اساس جرم مولکولی جدا می کند، دنبال می شود.

این روش که از زمان معرفی خود در اوایل دهه ۱۹۷۰ تا حد زیادی تغییر نکرده است، در کاربردهایی که نیازی به حفظ ویژگی های بومی ساختار یا عملکرد پروتئین ندارند، به خوبی کار می کند. بنابراین، ارزیابی خلوص نمونه های پروتئین، ارزیابی بیان پروتئین و شناسایی ایمونوشیمیایی کمی‌سازی پروتئین‌ها (وسترن بلات) روش‌هایی هستند که از SDS-PAGE استفاده می کنند.

محدودیت آشکار SDS-PAGE در دناتوره کردن عمدی پروتئین ها قبل از الکتروفورز است. فعالیت آنزیمی، فعل و انفعالات اتصال پروتئین، تشخیص کوفاکتورهای پروتئینی و غیره به طور کلی روی پروتئین های جدا شده توسط SDS-PAGE قابل تعیین نیستند. درعوض، روش‌های دیگری باید برای جداسازی پروتئین‌های بومی برای بررسی روابط ساختار-عملکرد به کار گرفته شوند.

یکی از این روش‌های جایگزین، تکنیک blue-native PAGE می باشد. این روش در تعیین برهمکنش‌های پروتئین-پروتئین استفاده شده است. پروتئین‌های نمونه به‌عنوان الیگومر در بعد اول BN-PAGE جدا می‌شوند و به دنبال آن یک SDS-PAGE بعد دوم دناتوره‌کننده برای شناسایی مونومرهای درون الیگومرها انجام می‌شود. با این حال، به عنوان یک روش جداسازی یک‌بعدی، با مشکلاتی روبرو می‌شود.

یک پیشرفت خوشایند می تواند روشی باشد که پروتئین های فردی را به خوبی حل می کند و این کار را در حالت اصلی آنها انجام می دهد. به طور خاص، چنین روشی به پروتئین ها اجازه می دهد تا به اندازه کافی جدا شوند. این می‌تواند برخی از محدودیت‌ها و نگرانی‌های کنونی در استفاده از PAGE در ارتباط با آنالیز متالوپروتئین را کاهش دهد.

با شرکت در کارآموزی طراحی دارو ژنیران دانش خود را در مورد تکنیک SDS-PAGE در محیط IN SILICO افزایش دهید:

دوره مهارت آموزی طراحی دارو

منبع