آلودگی مایکوپلاسما

فهرست مطالب نمایش

چگونه با دشمن نامرئی مبارزه کنیم؟

اگرچه وجود مایکوپلاسما در کشت سلولی در سال 1956 آشکار شد ، بسیاری از آزمایشگاهها هنوز هم امروزه با آلودگی مایکوپلاسما و تاثیر منفی آنها دست و پنجه نرم می کنند. خیلی بدتر ، اکثر دانشمندان حتی از حضور آنها اطلاع ندارند. این مقاله تهدیدهای مختلف مرتبط با آلودگی مایکوپلاسما را نشان می دهد و روش هایی برای پیشگیری ، تشخیص و حذف این انگل های تند و زننده از کشت سلولی شما نشان می دهد.

مایکوپلاسما چیست؟

با اندازه 0.2 – 0.8 میکرومتر ، مایکوپلاسماها کوچکترین ارگانیسمهای زنده را نشان می دهند. آنها در گروه باکتریهای گرم مثبت قرار دارند. از آنجا که فاقد دیواره سلولی هستند، با استفاده از آنتی بیوتیک های استاندارد مانند بسیاری از باکتری های دیگر نمی توان آنها را از بین برد.

ژنوم آنها فقط شامل 0.58 – 2.2 مگابایت DNA است ، که توانایی های بیوسنتزی محدود آنها را توضیح می دهد. در نتیجه ، نگهداری و رشد مایکوپلاسما به در دسترس بودن مواد مغذی و متابولیت از سلولهای میزبان بستگی دارد. اگرچه حدود 195 گونه مایکوپلاسما شناسایی شده است ، فقط 6 گونه مسئول 95٪ از تمام آلودگی های مایکوپلاسما در کشت سلول هستند:

orale
arginine
fermentans
hyorhinis
hominis
laidlawii 4

علائم آلودگی به مایکوپلاسما در کشت سلول من چیست؟

نکته ناخوشایند در مورد آلودگی مایکوپلاسما این است که بدون آزمایش خاص ، مورد توجه قرار نمی گیرد. آلودگی های مایکوپلاسما با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیست. علاوه بر این ، با توجه به اندازه محدود و نرخ سرعت رشد نسبتاً پایین این باکتری ها ، کشت های آلوده کاهش pH یا کدورت آشکار را نشان نمی دهد.

با این حال ، آلودگی های مایکوپلاسما ممکن است وجود داشته باشد و علی رغم استفاده منظم از آنتی بیوتیک ها ادامه داشته باشد و به طور قابل توجهی بر رویدادهای سلولی تأثیر بگذارد. در صورت مشاهده کاهش کارایی تکثیر یا انتقال ، تغییرات مورفولوژیکی یا تجمع سلول ها ، باید آزمایش آلودگی مایکوپلاسما را در نظر بگیرید.

چرا مایکوپلاسماها مشکل ساز هستند؟

در کشتهای سلولی آلوده ، این باکتریها با سلولهای هدف شما برای تأمین مواد مغذی رقابت می کنند و بیشتر آنها را در معرض متابولیتهای نامطلوب قرار می دهند. آنها بر سطح DNA ، RNA و سنتز پروتئین تأثیر می گذارند ، بیان ژن را تغییر داده و بر غشای سلولی ، اندامک ها ، مورفولوژی سلول و آنتی ژنتیک تأثیر می گذارند.

در نتیجه آنها می توانند رشد سلول ، متابولیسم سلولی را مهار کنند و ممکن است باعث مرگ سلول شوند. بنابراین ، یک آلودگی مایکوپلاسمای کشف نشده ، اعتبار نتایج شما را اساساً زیر سوال می برد.

تأثیرات عمده آلودگی مایکوپلاسما بر عملکرد سلولی

مایکوپلاسما از کجا می آید و چگونه می توان از آلودگی مایکوپلاسما جلوگیری کرد؟

انسان ، خوک و گاو میزبان بالقوه آلودگی به مایکوپلاسما هستند. راه اصلی عفونت از طریق تماس مستقیم یا غیرمستقیم با وسایل آلوده آزمایشگاهی ، یا موادی مانند سرم جنین گاوی یا از طریق کشت رده های سلولی آلوده است.

برای جلوگیری از آلودگی مایکوپلاسما ، باید از آسپتیک تکنیک های مناسب کشت سلول استفاده شود که شامل تمیز کردن معمول همه دستگاه های مورد استفاده مانند دستگاه انکوباتور ، بنچ های کار ، میکروسکوپ، هود یا حمام آب است.

همچنین توصیه می شود برای هر رده سلولی جداگانه و محیط کشت جداگانه اختصاص داده شود و فقط بر روی یک ظرف سلولی در یک زمان واحد کار شود. با این حال ، موثرترین روش این است که از تست های روتین و دقیق در فواصل زمانی مشخص (ماهانه / سه ماهه) استفاده کنید و رده های سلولی مشکوک به طور کامل قرنطینه شوند تا زمانی که جواب آزمایش آن ها منفی شود.

تکثیر مایکوپلاسماها در -196 درجه سانتیگراد متوقف می شود ، اما با این حال زنده می مانند و ممکن است از یک ویال به دیگری منتقل شوند. لازم به یادآوری است که سلولهای موجود در کرایوویال ها می توانند از طریق فاز مایع نیتروژن در هنگام ذخیره سازی در یک ظرف مشترک آلوده شوند.

از کدام تست های آلودگی مایکوپلاسما میتوانم استفاده کنم؟

اصولاً دو دسته آزمایش آلودگی به مایکوپلاسما وجود دارد. شما می توانید مستقیماً به دنبال مایکوپلاسما باشید، با کشت و شناسایی کل ارگانیسم ، یا می توانید با آزمایش بیان ژن خاص یا فعالیت آنزیم از برخی زیر واحدهای سلولی مایکوپلاسما استفاده کنید.

جدول زیر خلاصه ای از محبوب ترین روش های آزمایش برای تشخیص آلودگی مایکوپلاسما است. بسیاری از روشهای آزمایش توانایی شناسایی و تشخیص گونه های خاص را ندارند. با این حال ، این ویژگی در بیشتر موارد نیازی نیست چرا که در درجه اول ، مسئله تشخیص کلی رده های سلولی آلوده است.

محدودیت ها	مزایا	شرح تست	روش تست
وقت گیر ، پیچیده ، بسیار وابسته به تجربه کاربر ، شناسایی خاص فقط برای برخی از گونه ها امکان پذیر است ، کند	ارزان ، حساس ، خاص	مایع رویی کشت های مشکوک به محیط مخصوص و متعاقباً به آگار منتقل می شود. پس از حدود 2 هفته ، آلودگی های مایکوپلاسما به صورت کلنی های قابل مشاهده و در اصطلاح “تخم مرغ سرخ شده” ظاهر می شود.	کشت میکروبی (روش مرجع برای روش های جدید)
خاص ، حساسیت کم ، عدم شناسایی گونه	ارزان ، سریع ، ساده	کشت های سلولی مشکوک با رنگ آمیزی فلورسنت اسید نوکلئیک غیر اختصاصی (به عنوان مثال DAPI) رنگ آمیزی می شوند ، مایکوپلاسما ها را می توان به عنوان نقاط کوچکتر نزدیک به سلول های یوکاریوتی ، اما با فاصله تا هسته آنها مشخص کرد.	رنگ آمیزی DNA
عدم شناسایی گونه ، نتایج ممکن است بین رده های سلولی متفاوت باشد ، نیاز به luminescence microplate reader	سریع ، ساده ، ارزان ، خاص	مایکوپلاسما آنزیم هایی تولید می کند که در سلول های یوکاریوتی وجود ندارد. این آنزیم ها گردش یک سوبسترا را کاتالیز می کنند و در نتیجه فعالیت لوسیفراز / لومینسانس قابل خواندن در صفحه خوان لومینسانس است.	تشخیص بیوشیمیایی آنزیم ها
بهینه سازی به تجربه بستگی دارد ، ریسک تشخیص مثبت و منفی کاذب ، نیاز به انجام در شرایط بدون RNAse دارد ، ترموسایکلر مورد نیاز است	بسیار حساس ، خاص ، سریع ، نتایج عینی ، کیت های تجاری موجود	آلودگی های مایکوپلاسما با تکثیر PCR توالی های خاص ژنی که برای mycoplasma 16S rRNA کد می شوند ، تجزیه و تحلیل می شود. گونه های مختلف مایکوپلاسما را می توان با پرایمرهای خاصی که در نواحی بین ژنی 16S – 23S قرار دارند ، شناسایی کرد. DNA تقویت شده معمولاً با رنگهای فلورسنت ، چه بعد از جداسازی توسط الکتروفورز ژل ، چه در حین PCRریل تایم یا با اندازه گیری شدت فلورسانس نقطه پایان روی fluorescence plate reader کمی می شود.	تشخیص ژن از طریق PCR (استاندارد طلایی)
absorbance microplate reader نیاز است	ساده ، ارزان ، مناسب برای HTS	از آنتی بادی های مقابل آنتی ژن های سطحی مایکوپلاسما برای گرفتن زیر واحد ها و کمی سازی آنها بیشتر با خواندن جذب روی یک absorbance microplate readerاستفاده می شود.	تشخیص آنتی ژن های سطحی با ELISA
بسته به تجهیزات و تجربه ، نیاز به شرایط بدون RNAse دارد	خاص ، سریع ،ارزان	پروب ها با RNA یا DNA مایکوپلاسما هیبرید می شوند. آنها می توانند با یک گونه ، گروه خاص یا برای همه مایکوپلاسما سازگار باشند. سیگنال به عنوان نقاطی از ماده ترکیبی روی بلات ها یا به عنوان انتشار قابل تشخیص از هیبریداسیون مایع شناسایی می شود.	RNA / DNA ترکیبی
نیاز به شرایط بدون RNAse دارد	به PCR مراجعه کنید ، بدون ترموسایکلر ، runtime سریعتر مورد نیاز است	مانند PCR ، DNA مایکوپلاسما تکثیر شده و متعاقباً تشخیص داده می شود – با این حال ، در شرایط ایزوترمال و با استفاده از 4-6 پرایمر. از آنجا که دمای پایین و ثابت کافی است ، این روش را می توان بدون ترموسیکلر نیز انجام داد.	تشخیص ژن از طریق تکثیر در شرایط هم دمایی( ایزوترمال)

چگونه می توانم مایکوپلاسما را از کشت سلول خود حذف کنم؟

حیف است ، اما بهترین راه برای خلاص شدن از آلودگی مایکوپلاسما ، دفع کشت های سلولی آلوده با تمام مواد مصرفی مرتبط و تمیز کردن کامل تجهیزات مورد استفاده است.

با این وجود ، برخی گزینه ها برای ریشه کنی مایکوپلاسما در دسترس است. این موارد بیشتر براساس استفاده از آنتی بیوتیک های ترکیبی از جمله تتراسایکلین ها و ماکرولیدها به مدت چند هفته برای مهار سنتز پروتئین است. استفاده از آنتی بیوتیک ها در کشت های سلولی آلوده اغلب با عوارض جانبی مانند سمیت سلولی ، مهار رشد ، از بین رفتن ویژگی های سلولی همراه است.

با این حال ، خطرات مربوط به درمان با آنتی بیوتیک ها ممکن است قابل قبول تلقی شود اگر رده سلولی آلوده شده بسیار گران باشد یا شروع دوباره کار بسیار وقت گیر باشد و یا حتی غیر قابل تعویض باشد. رویکردهای جدید آنتی بیوتیک را با درمان های غیر آنتی بیوتیکی ترکیب می کند و نوید می دهد که مستقیماً گونه های رایج مایکوپلاسما را از بین می برد.

مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی

آرشیو جدیدترین خبرهای روز دنیای بیولوژی

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه