تکنیک تست Disk Diffusion

این آزمایش توانایی آنتی بیوتیک را برای جلوگیری از رشد باکتریها با مجموعه استانداردی که توسط CLSI (موسسه استاندارد آزمایشگاه بالینی) ایجاد شده است، مقایسه می کند تا از عملکرد آن در غلظت خاصی اطمینان یابد. به عنوان شاهد، از نوعی حساس به آنتی بیوتیک استفاده می کنیم تا اثربخشی آن و یک سویه مقاوم برای اطمینان از ماده صحیح آن مشخص شود. هر قطعه با روش زیر تست می شود.

مواد مورد نیاز

آنتی بیوتیک مورد نظر
آنتی بیوتیک کنترل (محصول قبلاً آزمایش شده)
· 1 کشت یک شبه از سویه مقاوم
· 1 کشت یک شبه از سویه مستعد
دیسک های کاغذ فیلتر واتمن 6 میلی متر
ظروف پتری استریل
· 2 صفحه آگار (بدون آنتی بیوتیک)
پنس
اتانول

پروتکل

روز قبل از تست، بخش های جدا شده ای از سویه های مستعد و مقاوم را انتخاب کنید و در طول شب (18 ساعت) یا به مرحله ثابت (به طور کلی 6 ساعت رشد) در 5 میلی لیتر محیط کشت در دمای 35-37 درجه سانتی گراد کشت دهید.
روز آزمایش، محیط کشت های خود را رقیق کنید. اندازه گیری تلقیح را با اندازه گیری میزان جذب در 600 نانومتر انجام دهید. در زمان انجام آزمایش، میزان جذب باید 5/0 در 600 نانومتر باشد.
در حالی که باکتری های محیط کشت شما رشد می کنند، محلول موجود در آنتی بیوتیک کنترل کنید (در صورت موجود بودن آنتی بیوتیک):
محلول استوک را می توان در غلظت استاندارد تهیه کرد. به عنوان مثال، 100 میلی گرم در میلی لیتر برای آمپی سیلین
محلول استوک را فیلتر و استریل کنید (این کار برای همه محلول های آبی توصیه می شود)
محلول را با نام آنتی بیوتیک، غلظت، تولید کننده / تأمین کننده ، تاریخ ایجاد شده برچسب بزنید
مقدار آنتی بیوتیک (وابسته به نوع آنتی بیوتیک) را برای قرار دادن در هر دیسک تعیین کنید و مقدار 1 میلی لیتر با آن غلظت تهیه کنید. 1 میلی لیتر محلول را برای آزمایش آنتی بیوتیک و کنترل آنتی بیوتیک ها تهیه کنید
در دو ظرف پتری، 8 قطعه کاغذ صافی را به یک ظرف و 4 عدد دیگر ر به ظرف دیگر اضافه کنید
6. 20 میکرولیتر از محلول آنتی بیوتیک را برای آزمایش به هر یک از 8 دیسک کاغذ فیلتر اضافه کنید. همچنین 20 میکرولیتر از محلول آزمایش شده قبلی را کنترل کرده و به 4 دیسک کاغذ فیلتر موجود در صفحه کنترل اضافه کنید
در حالی که دیسک ها در حال خشک شدن هستند، هر صفحه آگار را با محیط کشت مربوطه برچسب بزنید و به 6 بخش تقسیم کنید
پس از آماده شدن محیط های کشت خود، 150 میکرولیتر از محیط کشت را به طور مساوی در سراسر پلیت پخش کنید و اجازه دهید هر مایع اضافی موجود خشک شود
پس از خشک شدن دیسک ها، یک پنس را با شعاع استریل کنید. سپس یک دیسک خالی را در قسمت 1 هر صفحه قرار داده و با پنس آن را به آرامی فشار دهید