تکنیک ها, ژنتیک مولکولی, ویدیو های آموزشی, ویکی ژن
توالی یابی DNA به روش سنگر + ویدیو آموزشی
مقدمه‌ای بر توالی یابی DNA به روش سنگر
توالی‌یابی DNA (دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید (Deoxyribonucleic acid)) فرآیند شناسایی توالی دقیق نوکلئوتیدها (Nucleotides) یعنی آدنین (Adenine (A))، گوانین (Guanine (G))، سیتوزین (Cytosine (C)) و تیمین (Thymine (T)) در ژنوم یا مولکول DNA می‌باشد. به منظور تعیین توالی، اولین روش توالی‌یابی DNA با نام “روش خاتمه زنجیره‌ای” (Chain termination method) یا توالی‌یابی سنگر در سال 1997 توسط Frederick Sanger با استفاده از قطعات نیمه هضم شده نشانه‌گذاری شده با رادیواکتیو ایجاد شد. این روش به Frederick Sanger و تیمش امکان داد تا اولین ژنوم کامل ویروس phiX174 را توالی‌یابی کنند.
توالی‌یابی سنگر روش تعیین توالی است که در آن الیگونوکلئوتیدهای خاتمه دهنده زنجیره به عنوان پرایمر در طول فرایند تکثیر DNA در شرایط آزمایشگاهی رخ می‌دهد.
اجزای ضروری برای توالی‌یابی عبارتند از: مولکول‌های DNA تک رشته‌ای، DNA پلیمراز (DNA polymerase)، چهار تری‌فسفات دئوکسی‌ریبونوکلئوتید (Deoxyribonucleotide triphosphate) (dNTPs؛ dATP، dCTP، dGTP و dTTP) و تری‌فسفات‌های دیدئوکسی‌ریبونوکلئوتید (dideoxyribonucleotides triphosphat (ddNTPs؛ ddATP، ddCTP، ddGTP، و ddTTP) برچسب‌گذاری شده با نشانگرهای فلورسنت مختلف.
اصول توالی یابی DNA به روش سنگر
روش توالی‌یابی سنگر با افزودن تری‌فسفات دئوکسی‌نوکلئوتید و تری‌فسفات دیدئوکسی‌نوکلئوتید نشانه‌گذاری شده با یک نشانگر فلورسنت متفاوت که افزایش طول زنجیره را خاتمه می‌دهد، DNA مکمل یک الگوی DNA تک رشته‌ای را سنتز می‌کند. بر اساس این لیبل‌ها، توالی مشخص می‌شود.
اجزای توالی‌یابی
الگوی DNA
ماده اولیه برای تعیین توالی یک الگوی DNA تک رشته‌ای است که باید توالی‌یابی شود. در روش سنتی، DNA تک رشته‌ای با استفاده از یک وکتور (Vector) یا به وسیله دناتوره کردن DNA دو رشته‌ای با یک روش قلیا یا جوشاندن به دست می‌آمد. اما امروزه روش واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (Polymerase chain reaction (PCR)) در دستیابی به DNA تک رشته‌ای کمک می‌کند.
پرایمر
پرایمر یک اولیگونوکلئوتید (Oligonucleotide) کوتاه است که مکمل یک توالی کوتاه از الگوهای DNA است و به آن متصل می‌شود. نقش مهمی که پرایمر ایفا می‌کند، ناحیه‌ای از مولکول الگو که توالی‌یابی خواهد شد، می‌باشد.
آنزیم DNA پلیمراز
پرایمر را گسترش می‌دهد و نوکلئوتید مکمل را به الگو اضافه می‌کند. این پلیمراز فاقد فعالیت اگزونوکلئاز (Exonuclease) است زیرا ممکن است نوکلئوتید را در جهت ‘5-‘3 یا ‘3-‘5 تجزیه کند و بر دقت تعیین توالی تأثیر بگذارد.
نوکلئوتید تری‌فسفات
دو نوع مختلف نوکلئوتید در این روش استفاده می‌شود: تری‌فسفات‌های دئوکسی‌ریبونوکلئوتید و تری‌فسفات‌های دیدئوکسی‌ریبونوکلئوتید.
- تری‌فسفات‌های دئوکسی‌ریبونوکلئوتیدی: این‌ها تری‌فسفات‌های نوکلئوتیدی معمولی هستند که شامل بازهای نیتروژنی (A, T, G, C)، قند ریبوز (Ribose) با یک گروه هیدروکسیل در کربن ‘3 و گروه فسفات در کربن ‘5 هستند که به تشکیل پیوند فسفودی‌استر (Phosphodiester bond) بین هر تری‌فسفات دئوکسی‌ریبونوکلئوتید کمک می‌کنند.
- تری‌فسفات‌های دیدئوکسی‌ریبونوکلئوتیدی: این‌ها تری‌فسفات‌های نوکلئوتیدی اصلاح شده‌ای هستند که کربن ‘3 قند ریبوز، گروه هیدروکسیل ندارد. بنابراین، این نوکلئوتیدها به عنوان خاتمه دهنده‌های زنجیره ‘3 استفاده می‌شوند، زیرا پیوند فسفودی‌استر با نوکلئوتید ورودی بعدی تشکیل نمی‌شود.
مراحل مربوط به توالی‌یابی سنگر
افزایش طول و خاتمه زنجیره (Elongation and chain termination)
الگوی DNA که باید توالی‌یابی شود، تحت واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) قرار می‌گیرد، با این تفاوت که تری‌فسفات دیدئوکسی‌نوکلئوتید نیز به آن اضافه شده است. dNTPها، DNA پلیمراز، پرایمر و الگو همگی در واکنش معمول PCR هستند.
پرایمر به DNA الگو متصل می‌شود و DNA پلیمراز با افزودن تصادفی dNTPs یا ddNTPs، پرایمر را گسترش می‌دهد، اما هنگامی که ddNTP اضافه شود، واکنش خاتمه می‌یابد. این دئوکسی‌نوکلئوتیدها بزرگ‌تر از دیدئوکسی‌نوکلئوتیدها هستند، بنابراین خاتمه در نزدیکی ناحیه پرایمر رخ نمی‌دهد.
به عنوان مثال، اگر dATP در طول فرایند افزایش طول متصل شود، این فرایند را متوقف می‌کند و دنباله به صورت A خوانده می‌شود (در زیر نشان داده شده است). به طور مشابه، اگر ddGTP، ddTTP یا ddCTP اضافه شود، دنباله به ترتیب به صورت G، T یا C خوانده می‌شود.
روش سنتی این واکنش‌ها را در چهار لوله حاوی مخلوط‌های معمولی PCR انجام می‌دهد. با این حال، هر لوله حاوی تری‌فسفات دیدئوکسی‌نوکلئوتید (ddATP، ddCTP، ddTTP، یا ddGTP) است که به صورت رادیواکتیوی برچسب گذاری شده است.
از سوی دیگر، امروزه همه این واکنش‌ها در یک لوله با ddNTPها که هر کدام با رنگ فلورسنت متفاوتی برچسب‌گذاری شده‌اند، انجام می‌شوند.
الکتروفورز و شناسایی توالی
پس از فرایند تکثیر (Amplification)، الکتروفورز انجام می‌شود. مخلوط یا در ژل پلی‌آکریل‌آمید (Polyacrylamide gel) (در روش سنتی) یا در یک لوله سیستم ژل کپیلاری (Capillary gel system) قرار داده می‌شود. این مولکول‌ها بر اساس طولشان از هم جدا می‌شوند و هر کدام حاوی دیدئوکسی‌نوکلئوتید در انتهای خود هستند.
در روش سنتی، فرآورده‌ها از طریق ژل پلی‌آکریل‌آمید (ژل الکتروفورز) در چهار خط مجزا، جدا شده و بر اساس جرم مولکولی خود مانند شکل زیر تعیین توالی نوکلئوتیدی می‌شوند. بر اساس جرم آن‌ها و ddNTPهای نشانه‌گذاری شده با رادیواکتیو، بازها شناسایی می‌شوند. توالی آن‌ها در سمت چپ شکل زیر نشان داده شده است. شناسایی با کمک دستگاه اسپکتروفتومتر (Spectrophotometer) انجام می‌شود.
در روش جدید، فرآورده‌ها در یک کپیلاری شیشه‌ای پر شده با پلیمر جدا می‌شوند و از یک آشکارساز فلورسنت که تعیین می‌کند آیا هر مولکول بر اساس برچسب چسبیده به دیدئوکسی نوکلئوتیدها به A، T، G یا C ختم می‌شود یا نه، عبور می‌کنند.
مزایای روش توالی‌یابی سنگر
توالی‌یابی سنگر در مقایسه با سایر روش‌های توالی‌یابی مزایای بسیاری دارد که به شرح زیر است:
- برای آزمایش واریانت‌های همان خانواده‌ها اختصاصی‌تر است.
- اعتبار سنجی گسترده لازم نیست زیرا این روش بر روی یک یا تعداد کمی از دنباله‌های مورد نظر تأیید می‌شود.
- کمتر به ابزارهای محاسباتی وابسته است.
- برای یک نمونه مقرون به صرفه است.
محدودیت‌های روش توالی‌یابی سنگر
اگرچه توالی‌یابی سنگر روش ارجح برای تعیین توالی DNA است، اما محدودیت‌هایی نیز دارد که به شرح زیل می‌باشد:
- این روش فقط قطعات کوتاه DNA یعنی بازهای حدود 1 تا 300 کیلوبازی را توالی‌یابی می‌کند.
- نمی‌تواند ژن‌های مختلف را به طور همزمان شناسایی کند.
- به مقدار قابل توجهی DNA به عنوان ورودی نیاز دارد.
- از آن‌جایی که پرایمر به 15 تا 40 باز اول متصل می‌شود، کیفیت توالی‌ها در این ناحیه اغلب ضعیف است.
- روشی زمان بر است.
- در صورت استفاده از روش سنتی، توالی‌های وکتور کلونینگ (Cloning vector) ممکن است در توالی‌های پایانی وجود داشته باشند.
همچنین بخوانید:
مترجم: صادق حسینی‌کیا
سلام و وقت بخیر. هزینه توالی یابی ب روش سنگر؟؟
سلام، جهت استعلام قیمت و جزئیات با ما تماس بگیرید