مقدمه‌ای بر استخراج پلاسمید نوترکیب
تخلیص پلاسمیدها از کشت باکتری مانند روش کلی تهیه کل DNA از سلول است. ابتدا سلول های باکتریایی در محیط کشت رشد داده می‌شوند. رسوب سلول ها جمع آوری و یک عصاره سلولی آماده می‌شود که برای تخلیص پلاسمید مورد استفاده قرار میگیرد. در استخراج پلاسمید لازم است که DNA پلاسمیدی از مقدار زیادی DNA باکتریایی موجود در سلول جدا شود. جداسازی دو DNA کار بسیار دشواری است، اما وقتی قرار است پلاسمید برای کلون‌سازی مورد استفاده قرار گیرد، وجود کمترین میزان آلودگی نتایج نامطلوبی به همراه دارد.
روش‌های جداسازی پلاسمید بر اساس تفاوت‌های فیزیکی بین پلاسمید و DNA باکتری طراحی شده است.
انواع روش های جداسازی پلاسمید
جداسازی بر اساس اندازه
پلاسمید از لحاظ اندازه چیزی حدود هشت درصد اندازه DNA باکتریایی است که از این خاصیت برای جداسازی استفاده می‌شود. در این روش سلول‌ها تحت شرایط کنترل شده تجزیه شده که در نهایت تعداد کمی از DNA سلول شکسته شده که حتی در این حالت هم از پلاسمید بزرگتر است. پس از لیز سلولی، سانتریفوژ باعث رسوب DNA باکتری و عصاره سلولی می‌شود و پلاسمید در محیط رویی باقی می‌ماند.
جداسازی بر اساس ساختار فضایی
این مطلب که پلازمیدها دارای ساختار حلقوی هستند درست نیست. بیشتر پلاسمیدها در سلول به شکل مولکول‌های ابرمارپیچ وجود دارند که در حالت طبیعی به آن حلقوی بسته کولانسی گفته می‌شود و چنانچه در صورت ایجاد شکست در یکی از رشته‌ها ساختار دیگری به نام ساختار حلقه باز شکل میگیرد. این ساختار فضایی در جداسازی پلاسمید دارای اهمیت است که از دو روش دناتوره کردن قلیایی و اتیدیوم بروماید – سزیم کلرید استفاده می‌شود.
روش دناتوره کردن قلیایی
این روش بر این اساس استوار است که در محدوده خاصی از PH ،DNA باکتری دناتوره شده و ساختار پلازمید دناتوره نمی‌شود. چنانچه به عصاره سلولی سدیم هیدروکسید اضافه شود تا PH به دوازده برسد، پیوند هیدروژنی بین DNA باکتری از بین رفته و دو رشته از بین می‌رود، ولی ساختار فضایی ابرمارپیچ پلاسمید مانع از عملکرد سدیم هیدروکسید می‌شود. در ادامه کاهش PH باعث شده تا DNA باکتری به صورت یک توده درهم نامحلول شود و سانتریفوژ باعث رسوب این توده و عصاه سلولی می‌شود که در نهایت پلازمید در مایع رویی باقی می‌ماند.
روش اتیدیوم بروماید سزیم کلرید
در این روش با استفاده از سانتریفوژ محلول سزیم کلرید با سرعت بالا یک شیب چگال از سزیم کلرید به دست می‌آید که اجزای مختلف سلولی مانند RNA، DNA و پروتیین را در نقاط مختلف جای می‌دهد، چون هر کدام از این اجزا چگالی مختلفی دارند.
پس از آنکه DNA از دو جز دیگر جدا شد باید پلازمید را از DNA باکتری جدا کنیم. برای این کار از اتیدیوم بروماید استفاده می‌شود. این ماده بین دو دشته DNA قرار گرفته و باعث باز شدن نسبی مارپیچ DNA شده که این باز شدگی نسبی باعث تغییر چگالی می‌شود. اتیدیوم بروماید بدلیل اینکه پلازمید ساختار ابرمارپیچ دارد، کمتر بر روی پلاسمید اثر کرده و این اثر کمتر باعث شده چگالی پلازمید کمتر تغییر کند و در ستون شیب چگال بین پلاسمید و DNA باکتری فاصله بیفتد که حال می‌توان پلازمید را جدا کرد.
همچنین بخوانید:
من میخواستم پلاسمید به روش جوشاندن در حجم بالا انجام دهم.آیا باید اول با بافر لیز کننده سلولی مجاورت کنم بمدت ۵ دقیقه در دمای ۱۰۰ درجه بعد سانتریفیوژ کنم مایع رویی را بردارم؟
روش جوشاندن یکی از روش‌های سنتی برای استخراج پلاسمید از باکتری‌ها است که به دلیل سادگی و کم هزینه بودن مورد استفاده قرار میگیرد. با این حال، باید دقت شود که این روش می‌تواند باعث تخریب DNA نیز شود و باید با دقت انجام شود. در ادامه مراحل کلی برای استخراج پلاسمید به روش جوشاندن آمده است:
مراحل استخراج پلاسمید به روش جوشاندن:
کشت باکتری‌ها:
باکتری‌های حامل پلاسمید را در محیط کشت مایع (مانند LB broth) کشت دهید و اجازه دهید تا به طور کامل رشد کنند (معمولاً یک شب در دمای 37 درجه سانتی‌گراد).
برداشت سلول‌ها:
باکتری‌ها را با سانتریفیوژ کردن در 6000-8000 g به مدت 5-10 دقیقه برداشت کنید و محیط کشت را دور بریزید.
لیز سلولی:
رسوب سلولی را در بافر لیز کننده (مثلاً بافر گلوکز-تریس-EDTA یا بافر لیز قلیایی) معلق کنید و خوب مخلوط کنید.
برای تسریع لیز سلولی میتوانید از لیست شدن (Lysis buffer) که معمولاً شامل SDS و NaOH است استفاده کنید.
جوشاندن:
لوله‌ها را در آب جوش (100 درجه سانتی‌گراد) به مدت 5 دقیقه قرار دهید. این مرحله باعث لیز سلول‌ها و آزادسازی پلاسمید می‌شود.
سانتریفیوژ:
بعد از جوشاندن، لوله‌ها را سریعاً سرد کرده (مثلاً با قرار دادن در یخ) و سپس سانتریفیوژ کنید (12000 g به مدت 10 دقیقه).
مایع رویی (supernatant) را که حاوی پلاسمید است، با دقت بردارید.
خالص‌سازی پلاسمید:
اگر نیاز به خلوص بالاتر دارید، میتوانید از روش‌های اضافی مانند ترسیب با ایزوپروپانول و شستشو با اتانول استفاده کنید.
روش‌های ستون‌های اسپین یا کیت‌های تجاری نیز می‌توانند برای افزایش خلوص پلاسمید مورد استفاده قرار گیرند.
نکات مهم:
پایداری پلاسمید: دمای بالا می‌تواند به DNA آسیب برساند. بنابراین دقت کنید که زمان جوشاندن خیلی طولانی نشود.
آلودگی: اطمینان حاصل کنید که تمام ابزار و مواد مورد استفاده استریل و بدون آلودگی باشند تا از آلودگی پلاسمید جلوگیری شود.
کنترل کیفیت: پس از استخراج، از روش‌های کنترل کیفیت مانند الکتروفورز ژل آگارز برای بررسی کیفیت و کمیت پلاسمید استفاده کنید.
با رعایت این نکات، میتوانید پلاسمید را به روش جوشاندن استخراج کنید. اگر نیاز به مقادیر زیادی پلاسمید با خلوص بالا دارید، ممکن است روش‌های دیگر مانند کیت‌های تجاری مناسب‌تر باشند.
ممنون از آزمایشگاه به روز و تمیزتون…فضا خیلی مرتب و فعال بود
سلام دوست عزیز . ممنون از دیدگاهتون
میشه یه دوره رو به صورت فشرده شرکت کرد؟
سلام میتوانید به صورت خصوصی شرکت کنید.
سلام میخواستم بپرسم نقش tric_cl در بافر اول یا محلول اول و نقش SDS و NaOH در محلول دوم و پتاسیم استات و Glacial acetic acid در محلول سوم نقششون چیه؟؟؟
نقش Tris به عنوان بافر تنظیم pH دارد.
نقش SDS تخریب دیواره و غشا باکتری و نقش NaOH بازی کردن محیط برای جداسازی دو تا رشته ی DNA از هم.
پتاسیم استات و اسید استیک نقششون کم کردن تاثیر بازی بودن محیط توسط محلول قبلی، و رسوب دهی DNA کروموزومی و جداسازی پلازمید.
سلام ببخشید من یجایی خوندم که به بافر اول توی استخراج پلاسمید گلوکز اضافه کردن میخاستم دلیلشو بدونم
اضافه کردن گلوکز به بافر به حفظ اسمولاریته کمک می کنه که در حین اضافه کردن سلول ها نترکن