اطلاعات عمومی
آشنایی با وکتورها، آنزیم های نوترکیب
پلاسمید ها مولکول هایی حلقوی از جنس DNA هستند که به شکل مستقل در سلول باکتریایی حضور دارند. تقریباً همه پلاسمیدها یک یا چند ژن حمل می‌کنند که این ژنها مسئول نمایش یک ویژگی مفید توسط میزبان باکتری هستند. برای مثال توانایی زنده ماندن آنها در غلظت‌های از آنتی‌بیوتیک‌ها مانند کلرامفنیکل یا آمپی سیلین که به شکل طبیعی برای سلول کشنده است اغلب به دلیل حضور پلاسمید حمل کننده ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک در باکتری می باشد.
در کلونینگ دو نوع حامل وجود دارد: 1. پلاسمید مخصوص کلونینگ ژن مورد نظر 2. پلاسمید مخصوص بیان پروتئین
پلاسمید pBR322 به عنوان یک حامل کلونینگ
در این پلازمید p بیانگر آن است که این حامل در حقیقت یک پلاسمید است.
همچنین BR بیانگر آزمایشگاهی است که حامل در اصل در آن ایجاد می شود.
و ۳۲۲ بیانگر آن است که این پلاسمید را از سایر پلاسمید های توسعه یافته در همان آزمایشگاه متمایز می سازد.
اولین خصوصیت سودمند این پلاسمید اندازه آن می باشد. یک حامل کلون سازی باید کمتر از ۱۰ کیلو باز باشد تا مانع از مشکلاتی مانند تفکیک DNA از ژنوم میزبان در طی فرایند تخلیص شود. این پلاسمید دارای اندازه ۴۳۶۳ نوکلئوتید است، این بدان معنا است که نه تنها حاملی است که می تواند به آسانی تخلیص شود بلکه هر مولکول dna نوترکیب را می‌توان با استفاده از این حامل ایجاد کرد. با وجود قطعه dna حتی ۶ کیلو باز یک مولکول p BR322 نوترکیب هنوز در اندازه است که قابل کنترل می باشد. این حامل دو مجموعه از ژن های مقاومت به آنتی بیوتیک را حمل می کند. مقاومت به آمپی سیلین یا تتراسایکلین به عنوان یک مارکر انتخاب پذیر برای سلول‌های حاوی پلاسمید استفاده میشود و هر ژن مارکر حاوی جایگاه های محدود کننده منحصر به فردی است که می‌توانند در آزمایشات کلون سازی استفاده شوند. با ورود ژن خارجی به به درون جایگاه هر کدام از آنتی‌بیوتیک ها منجر به غیر فعال سازی مقاومت سلول نسبت به آن آنتی بیوتیک میشود.
pET28a به عنوان حامل بیانی:
یک وکتور بیانی است. از ویژگی های وکتور بیانی حضور پروموتر، ترمیناتور و جایگاه اتصال ریبوزوم است. وکتور های بیانی باعث رونویسی از ژن و سپس تولید پروتئین می شوند.
این پلاسمید دارای ویژگی های زیر است:
His_tag: که به عنوان یک تگ به ابتدا و انتهای پروتئین اضافه می شود و نقش آن در تخلیص و تایید پروتئین مورد نظر است.
T7 terminator: توالی خاتمه رونویسی آنزیم RNA پلی مراز باکتریوفاژ T7
ژن مقاومت به کانامایسین یا KanR: باعث مقاومت باکتری به آنتی بیوتیک کانامایسین میشود.
ناحیه ori: به عنوان مبدا همانند سازی است. این پلاسمید جزء پلاسمید هایی با کپی بالا هستند.
lacI: پروتئین تولید شده از ژن lacI به رپرسور متصل و مانع رونویسی می شود.
T7 promoter: پروموتور اصلی که قبل از ژن اصلی قرار دارد و جایگاه اتصال به آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7 است و شروع رونویسی است.
Lac operator: جایگاه اتصال پروتئین تولید شده از ژن lac I است که مانع فعالیت آنزیم RNA پلیمراز باکتریوفاژ T7 و رونویسی می شود.
RBS یا ناحیه اتصال ریبوزوم است.
ATG: کدون آغاز می باشد که متیونین را کد می کند.
Thrombin site: یک جایگاه برشی است که توسط آنزیم ترومبین در توالی پروتئین شناسایی و برش داده می شود.
T7 tag: یک تگ تخلیص پروتئین و شناسایی و تایید پروتئین است.
MCS یا multiple cloning site: جایگاه ورود ژن خارجی.
اولین خصوصیت سودمند این پلاسمید اندازه آن می باشد. یک حامل کلون سازی باید کمتر از ۱۰ کیلو باز باشد تا مانع از مشکلاتی مانند تفکیک DNA از ژنوم میزبان در طی فرایند تخلیص شود.
خیلی از کامنتها رو بررسی و مطالعه کردم و اکثرا راضی بودن و من هم ثبتنامم رو انجام میدم ان شالله خوب باشه
سلام ممنون از نظرتون
تشکر از آزمایشگاه مجهز و تمیزتون.
بدون مشکل دوره امون رو پیش بردیم
سلام دوست عزیز ممنون از دیگاهتون
فواید پلاسمید ها چی هستند؟در چه صورت پلاسمیدها دچار مشکل میشن؟