اخبار علمی
جداسازی نوتروفیل های انسانی
جداسازی نوتروفیل های انسانی
نوتروفیل های چند هسته ای انسان (PMN) فراوان ترین سلول هسته دار در خون در حال گردش است. PMN دارای گرانولهای مشخصه سیتوپلاسمی حاوی پلی پپتیدهای ضد میکروبی است و می تواند گونه های اکسیژن فعال ضد میکروبی تولید کند. چرخه زندگی PMN شامل بلوغ و آزاد شدن از مغز استخوان ، گردش خون ، پایبندی سست به اندوتلیای عروقی و پاکسازی PMN پیری توسط سیستم رتیکولواندوتلیال است. در صورت فعال شدن ، PMN محیطی به اندوتلیای عروقی می چسبد و از عروق خارج می شود و در جهت محرک های عفونی یا التهابی حرکت می کند ، فرایندی که رفتار آنها را به طور قابل توجهی تغییر می دهد. با برخورد با میکروب ها ، PMN ممکن است تله های خارج سلولی نوتروفیل (NET) ایجاد کند ، محتوای گرانول آنها را آزاد کند ، واسطه های التهابی تولید کند ، گونه های واکنش اکسیژن (ROS) تولید کند و میکروب ها را از طریق فاگوسیتوز غرق کند. پس از فعال شدن ، PMN می تواند به عنوان یک واکنش التهابی در حال تکامل سهیم باشد و یا تحت آپوپتوز قرار گیرد که با فاگوسیتوز PMN توسط ماکروفاژهای بافتی به اوج خود می رسد.
با توجه به عمر نسبتاً کوتاه PMN در محیط کشت ، شروع آزمایش بدون تأخیر پس از جدا شدن از خون ، ضروری است. با این وجود ، PMN پس از جمع آوری حداکثر تا 24 تا 48 ساعت می تواند در خون ضد انعقاد زنده بماند و در نتیجه اجازه انتقال خون بیمار از طریق پیک شبانه را می دهد. در صورت حمل نمونه های بیمار ، حمل نمونه های اهدا کننده سالم برای محاسبه اثرات حمل و نقل و تأخیر در پردازش روی نقاط نهایی بیولوژیکی ضروری است.
PMN کاملاً حساس به آلودگی های رایج است. تمام محیط ها و موادی که با خون یا سلول ها تماس می گیرند باید فاقد پیروژن باشند. در مواردی که مشخص نشده باشد ، خون و سلولها را در PH فیزیولوژیک ، دمای اتاق و در صورت عدم وجود کاتیونهای دو ظرفیتی حفظ کنید تا بتواند باعث محدود شدن فعال سازی شود. برای کاهش فعال سازی PMN ناشی از چسبندگی ، لوله های پلی پروپیلن فاقد پیروژن توصیه می شود. از پیپتهای بدون پیروژن و نوک پیپتها (ترجیحاً با موانع آئروسل) باید استفاده شود. استفاده از یک کابینت ایمنی زیستی با هوای فیلتر شده HEPA ممکن است احتمال فعال شدن سلول را بیشتر کاهش دهد.
پروتکل جداسازی نوتروفیل ها با استفاده از شیب تراکم مبتنی بر Percoll
جداسازی PMN خون محیطی انسان شامل حذف گلبول های قرمز خون (RBC) با استفاده از دکستران و لیز هیپوتونیک RBC باقیمانده است.PMN از PBMC با استفاده از شیب های تراکم یا جداسازی مبتنی بر Percoll که در این پروتکل شرح داده شده یا Ficoll-Paque premium به عنوان یک شیب چگالی (پروتکل جایگزین) جدا می شود.
- لوله های خون گیری را با سرعت 400 g به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کنید.
- پلاسما (فاز فوقانی) را به لوله فالکون 15 میلی لیتری جدید منتقل کرده و دوباره سانتریفیوژ کنید تا تمام لکوسیت ها از پلاسما جمع شوند.
- پلت غنی را به لوله جدید انتقال دهید و به مدت 10 دقیقه در ≥ 2000 g سانتریفیوژ کنید تا پلاکت خارج شود.
- لایه حاوی RBC را از لوله های خون گیری به درون لوله فالکون 50 میلی لیتری انتقال دهید سپس خون را با چند میلی لیتر HBSS (-) به حجم برسانید تا بازده کار افزایش یابد و بعد آن به لوله 50 میلی لیتری منتقل شود.
- 5. 25 میلی لیتر 3٪ دکستران اضافه کرده و 5 بار آن را وارونه کنید تا مخلوط شود. اجازه دهید به مدت 20-40 دقیقه رسوب کند.
- مایع اضافی حاوی لکوسیت ها را درون یک لوله مخروطی مخلوط 50 میلی لیتری تازه پیپت کنید. تا آنجا که ممکن است لایه RBC رسوب شده را پشت سر بگذارید.
- سانتریفیوژ در 500 g 10 دقیقه
- حل کردن پلت در بافر سالین 0.9 درصد
- اضافه کردن محلول بدست آمده به محلول فایکول
- سانتریفیوژ در 500 g به مدت 40 دقیقه
- جدا کردن لایه سفید میانی و انتقال آن به فالکون جدید
- لیز کردن RBC ها با بافر سالین 1.8 درصد
- سانتریفیوژ سپس شست و شوی پلت تا شفاف شدن مایع رویی
برای مطالعه سایر تکنیک آزمایشگاهی کلیک کنید.
برای مشاهده و ثبت نام دوره کارآموزی کشت سلولی اینجا کلیک کنید
برای سفارش خدمات به آزمایشگاه کشت سلول ژنیران اینجا کلیک کنید
سلام وقت بخیر. میخواستم پروتکل جداسازی نوتروفیل با محلول percoll رو بدونم
جداسازی نوتروفیل‌ها با استفاده از محلول Percoll یکی از روش‌های متداول و مؤثر برای جداسازی این نوع سلولها از نمونه‌های خون است. Percoll یک ماده‌ی گرادیان چگالی است که امکان جداسازی سلولها بر اساس چگالی آنها را فراهم می‌کند. در اینجا یک پروتکل اساسی برای جداسازی نوتروفیل‌ها با استفاده از Percoll آورده شده است:
مواد لازم:
خون کامل آنتی‌کواگوله شده
محلول دکستران برای صاف کردن خون
محلول سدیم سیترات یا EDTA به عنوان آنتی‌کواگولانت
محلول Percoll
بافر PBS (فسفات بافر سالین)
سانتریفیوژ
مراحل جداسازی:
آماده‌سازی خون: خون کامل را با آنتی‌کواگولانت مانند EDTA یا سدیم سیترات مخلوط کنید.
صاف کردن خون: خون را با دکستران مخلوط کنید (معمولاً ۳% دکستران در مقدار کافی برای رقیق کردن خون استفاده می‌شود) و اجازه دهید برای حدود ۳۰ تا ۴۵ دقیقه در دمای اتاق قرار بگیرد تا سلول‌های قرمز خون ته‌نشین شوند.
جمع‌آوری لایه لوکوسیت: لایه فوقانی حاوی پلاسما و لوکوسیت‌ها را جمع‌آوری کنید.
سانتریفوژ با Percoll: محلول Percoll را آماده کنید. معمولاً گرادیان‌های چگالی 45% و 65% برای جداسازی نوتروفیل‌ها استفاده می‌شود. لایه‌های لوکوسیتی جمع‌آوری شده را بر روی گرادیان Percoll قرار دهید و سپس سانتریفیوژ کنید (معمولاً در حدود ۳۰ دقیقه با سرعت ۴۰۰ تا ۵۰۰ xg).
جمع‌آوری نوتروفیل‌ها: پس از سانتریفوژ، نوتروفیل‌ها معمولاً در فاصله بین لایه‌های 45% و 65% قرار می‌گیرند. این لایه را به آرامی جمع‌آوری کنید.
شستشو: نوتروفیل‌های جمع‌آوری شده را با PBS شستشو دهید و دوباره سانتریفیوژ کنید تا تمامی باقیمانده Percoll پاک شود.
استفاده از نوتروفیل‌ها: نوتروفیل‌های تمیز شده آماده استفاده در آزمایش‌های بیولوژیکی یا کشت سلولی هستند.
این پروتکل نقطه شروع خوبی برای جداسازی نوتروفیل‌ها است، اما ممکن است بر اساس نوع نمونه و نیازهای خاص تحقیق، تنظیماتی لازم باشد.
خیلی ممنون از پاسخ گویی شما،
اگر امکانش هست درمورد دکستران استفاده شده در پروتکل هم توضیح بفرمایید، از کدام نوع دکستران استفاده شده؟ با همه نوع دکستران قابل انجام هست؟ نحوه تهیه محلول دکستران رو هم بفرمایید.
خیلی ممنون از پاسخ گویی شما
جداسازی نوتروفیل‌های انسانی با استفاده از دکستران
جداسازی نوتروفیل‌ها از خون محیطی انسان یکی از مراحل مهم در تحقیقات ایمونولوژی و سلولی است. دکستران به عنوان یک ماده مهم در جداسازی نوتروفیل‌ها به کار می‌رود. در اینجا به توضیح استفاده از دکستران در این پروتکل و نحوه تهیه محلول دکستران می‌پردازیم.
نوع دکستران استفاده شده
در بیشتر پروتکل‌های جداسازی نوتروفیل‌های انسانی، از دکستران با وزن مولکولی 500,000 (Dextran T-500) استفاده می‌شود. این نوع دکستران به دلیل وزن مولکولی بالا، موثرترین گزینه برای رسوب کردن گلبول‌های قرمز و جداسازی نوتروفیل‌ها است.
آیا با همه نوع دکستران قابل انجام است؟
به طور کلی، جداسازی نوتروفیل‌ها با استفاده از دکستران به وزن مولکولی آن بستگی دارد. دکستران با وزن مولکولی بالا (مانند 500,000 یا بالاتر) به طور موثرتری گلبول‌های قرمز را رسوب می‌دهد. استفاده از دکستران با وزن مولکولی پایین‌تر ممکن است کارآیی جداسازی را کاهش دهد.
نحوه تهیه محلول دکستران
مواد لازم:
دکستران T-500
NaCl (محلول نمکی)
آب مقطر
تجهیزات آزمایشگاهی مانند ترازوی دقیق، همزن، و ظروف استریل
تهیه محلول دکستران:
تهیه محلول نمکی: یک محلول نمکی 0.9% (9 گرم NaCl در 1 لیتر آب مقطر) تهیه کنید.
وزن‌کشی دکستران: مقدار مناسب دکستران T-500 را وزن کنید. برای تهیه محلول 6%، 60 گرم دکستران در 1 لیتر محلول نمکی لازم است.
حل کردن دکستران: دکستران وزن شده را به آرامی به محلول نمکی اضافه کنید و به آرامی هم بزنید تا دکستران کاملاً حل شود. این فرآیند ممکن است چند ساعت طول بکشد، بنابراین بهتر است از یک همزن مغناطیسی استفاده کنید.
استریل کردن: پس از حل شدن دکستران، محلول را از طریق فیلتر 0.22 میکرونی عبور دهید تا استریل شود. محلول استریل شده را در ظروف استریل نگهداری کنید.
پروتکل جداسازی نوتروفیل‌ها:
خون گیری: از فرد داوطلب خون گرفته و در لوله‌های حاوی آنتی‌کوآگولانت (مثل EDTA) جمع‌آوری کنید.
اضافه کردن دکستران: به حجم مساوی خون، محلول دکستران 6% اضافه کنید و به آرامی مخلوط کنید.
رسوب دادن: مخلوط خون و دکستران را در دمای اتاق به مدت 30-45 دقیقه به حال خود بگذارید تا گلبول‌های قرمز رسوب کنند.
برداشتن لایه پلاسمایی: پس از رسوب گلبول‌های قرمز، لایه بالایی (پلاسمای حاوی نوتروفیل‌ها) را به آرامی برداشته و به لوله جدیدی منتقل کنید.
سانتریفیوژ کردن: پلاسمای حاوی نوتروفیل‌ها را در 400-500 g به مدت 10-15 دقیقه سانتریفیوژ کنید تا نوتروفیل‌ها رسوب کنند.
شستشو و تعلیق: رسوب نوتروفیل‌ها را با بافر مناسب (مثل PBS) شستشو داده و دوباره در بافر مناسب تعلیق کنید.
خیلی ممنون از پاسخ جامع و مفیدتان