مانت های لاکتوفنول کاتن بلو (Lactophenol Cotton Blue (LPCB))

مقدمه‌ای بر مانت های لاکتوفنول کاتن بلو 

تهیه لام مرطوب (Wet mount) لاکتوفنول کاتن بلو (LPCB) پرکاربردترین روش رنگ‌آمیزی و مشاهده قارچ‌ها است و تهیه آن ساده می‌باشد. این آماده‌سازی شامل اجزاء اصلی زیر است:

1. فنول، قارچ‌ها را از بین می‌برد.
2. اسید لاکتیک (Lactic acid) به عنوان یک عامل پاک کننده عمل کرده و به حفظ ساختارهای قارچی کمک می‌کند.
3. رنگ کاتن بلو یک رنگ آنیلین (Aniline) است که کیتین (Chitin) را در دیواره‌های سلولی قارچ رنگ می‌کند و به ساختار قارچ رنگ می‌بخشد و در نتیجه کنتراست ساختارها را افزایش می‌کند.
4. گلیسرول (Glycerol) یک ماده چسبناک است که از خشک شدن نمونه لام (Slide) آماده شده جلوگیری می‌کند.

محلول لاکتوفنول کاتن بلو یک محیط مانتینگ (Mounting medium) و عامل رنگ‌کننده است که در آماده‌سازی لام برای بررسی میکروسکوپی قارچ‌ها استفاده می‌شود. عناصر قارچی به شدت آبی رنگ می‌شوند. این عمل همیشه باید زیر یک هود ایمنی بیولوژیکی (Biological safety hood) انجام شود و همیشه باید از دستکش استفاده شود.

روش

آماده‌سازی به روش استاندارد Tease

1. یک قطره الکل 70 درصد را روی یک لام میکروسکوپ تمیز بریزید.

مواد حاصل از کشت قارچ‌های رشته‌ای باید با استفاده از یک سیم تلقیح سفت، نه لوپی (Loop) که برای آزمایش روی باکتری‌ها یا مخمرها استفاده می‌شود، برداشته شود.

2. سیم را با عمودی نگه داشتن آن در داغ‌ترین قسمت شعله چراغ بونزن (Bunsen)، درست بالای شعله آبی، حرارت دهید تا تمام طول سیم به به خاطر حرارت سرخ شود.

باید اطمینان حاصل کنید که سیم تلقیح قبل از قرار دادن آن در محیط کشت قارچی سرد شده باشد (پس از حدود ده ثانیه باید به اندازه کافی خنک شود).

3. درپوش را از لوله کشت بردارید (اما آن را روی میز قرار ندهید). با زدن شعله به قسمت گردن لوله، میکروارگانیسم‌های آلوده کننده را از بین ببرید.
4. مقدار کمی از کشت را بردارید.

برداشتن مقدار کمی از محیط آگار همراه با قارچ اغلب مفید است. در هر صورت، هنگام انتقال مواد به اسلاید باید تا حد امکان کمتر دچار دست خوردگی شود.

5. یک بار دیگر شعله را به قسمت گردن لوله زده و درپوش را تعویض کنید.
6. مواد قارچی را در قطره الکل 70 درصد فرو ببرید.

این کار هوای محبوس شده بین هیف‌ها (Hyphae) را خارج می‌کند.

7. با سوزن‌های نصب‌شده (mounted needles)، مواد را به آرامی از بین بکشید.

فراموش نکنید که سیم تلقیح و سوزن‌ها را پس از استفاده با حرارت دادن تا حد سرخ شدن با شعله چراغ بونزن استریل کنید.

8. قبل از اینکه الکل خشک شود یک یا حداکثر دو قطره از رنگ را اضافه کنید.

یک اشتباه رایج اضافه کردن رنگ بیش از حد در زمان آماده‌سازی است.

9. لامل را بین انگشت اشاره و شست خود نگه دارید، یک لبه قطره رنگ را با لبه لامل تماس دهید.
10. لامل را به آرامی بر روی لام پایین بیاورید، سعی کنید از ایجاد حباب‌های هوا جلوگیری کنید.

لام تهیه شده شما اکنون برای آزمایش آماده است.

دست زدن به کلنی اغلب ساختارهای هاگ‌دان ظریف قارچ‌های رشته‌ای را مختل می‌کند و در برخی موارد مشاهده آرایش مشخصه هاگ یا اتصالات هیف لازم برای شناسایی قطعی را دشوار می‌کند. در چنین مواردی، ممکن است نیاز به قرار دادن نمونه بر روی لام با نوار شفاف یا کشت میکرو اسلاید (Microslide) باشد.

آماده‌سازی به روش نوار سلفون (Cellophane Tape)

روش نوار سلفون یا نوار شفاف برای بررسی میکروسکوپی قارچ‌ها، ساده، ارزان و سریع است. این روش آرایش‌های مخروطی قارچ‌‌های رشته‌ای ظریف‌تر را حفظ می‌کند و به فرد امکان شناسایی دقیق را می‌دهد.

1. یک قطره رنگ لاکتوفنول آنیلین بلو (Aniline blue) را روی لام میکروسکوپ قرار دهید.
2. قسمت چسبنده نوار سلفون شفاف و غیر مات را به آرامی اما محکم به سطح کلنی فشار دهید و بخشی از میسلیوم هوایی (Aerial mycelium) را بردارید.
3. یک انتهای نوار را به سطح لام که در مجاورت قطره رنگ قرار دارد، بچسبانید.
4. نوار را روی رنگ بکشید و سپس به آرامی آن را پایین بیاورید تا میسلیوم به رنگ نفوذ کند.
5. نوار را محکم بکشید و انتهای مخالف آن را به شیشه بچسبانید و تا حد امکان از به دام افتادن حباب‌های هوا جلوگیری کنید.
6. لام تهیه شده شما اکنون برای آزمایش آماده است.

بررسی

1. بررسی اولیه را با استفاده از یک لنز شیئی با بزرگ‌نمایی کم انجام دهید. قسمت‌های نازک‌تر لام آماده شده که معمولاً در اطراف لبه‌های مواد اضافه شده می‌باشد، بهترین تصاویر را ارائه می‌دهند.
2. جهت بررسی دقیق‌تر اسپور‌ها (Spore) و سایر ساختارها، با یک لنز شیئی قوی با بزرگ‌نمایی 40 برابری آن‌ها را مشاهده و ارزیابی کنید.

ترکیب مانت لاکتوفنول کاتن بلو

آماده‌سازی مانت LPCB

لاکتوفنول کاتن بلو (LPCB) را می‌توان از تامین کنندگان تجاری خریداری کرد یا با مخلوط کردن مواد ذکر شده در بالا طبق مراحل زیر، تهیه کرد.

1. 20 میلی‌لیتر اسید لاکتیک را در یک بشر بریزید.
2. 40 میلی‌لیتر گلیسرول یا گلیسیرین اضافه کنید.
3. 20 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنید.
4. 22 گرم از کریستال‌های فنول (22 میلی‌لیتر فنل آب شده) اضافه کنید.
5. 05 گرم آنیلین بلو اضافه کنید.
6. محلول را حرارت داده و هم بزنید تا رنگ حل شود. از جوشاندن یا بالاتر بردن حرارت به بیش از 100 درجه سانتی‌گراد خودداری کنید.
7. محلول را خوب مخلوط کنید و اجازه دهید خنک شود. می‌توانید محلول را در دمای اتاق نگه‌داری کنید و در صورت نیاز آن با پیپت (Pipette) از آن استفاده کنید.

همچنین بخوانید:

• رنگ آمیزی اورامین-رودامین (Auramine- Rhodamine Staining): تعریف، روش کار، کاربردها و تفسیر نتایج
• رنگ آمیزی آیرون هماتوکسیلین (Iron-Hematoxylin Staining): اصول، روش، کاربرد و نتایج
• رنگ آمیزی تریکروم ویتلی (Wheatley Trichrome Staining): تعریف، اصول، روش و تفسیر نتایج
• رنگ آمیزی سابین-فلدمن (Sabin-Feldman dye test): اصول و محدودیت‌ها

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا