MTT چیست؟

مقدمه‌ای بر تست MTT

روش MTT یک روش رنگ سنجی برای ارزیابی فعالیت متابولیک سلول است. آنزیم های اکسیدوروکتاز سلول سلولی وابسته به NAD (P)، می توانند در شرایط تعریف شده، تعداد سلول های زنده موجود را مشخص کنند.

این آنزیم ها قادر به کاهش رنگ تترازولیوم MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide به بلور های نامحلول فرمازان نامحلول آن هستند که رنگ بنفشی را نمایان می کنند. از دیگر رنگ های تترازولیوم می توان به XTT، MTS و WST ها اشاره کرد که گیرنده الکترون میانی در آن ها، متوسولفات 1-متوکسی فنازین (PMS) است. با WST-1، غیر قابل نفوذ به سلول است و از طریق انتقال الکترون از غشا پلاسمایی، فرایند کاهش در خارج از سلول را انجام می دهد.

از روش های رنگ تترازولیوم همچنین می توان برای اندازه گیری سمیت سلولی (از دست دادن سلول های زنده) یا بررسی فعالیت سیتواستاتیک (تغییر از فاز تکثیری به سکون) عوامل دارویی بالقوه و مواد سمی استفاده کرد. سنجش های MTT معمولاً در تاریکی انجام می شوند زیرا معرف MTT به نور حساس است.

MTT و نمک های تترازولیوم مرتبط

MTT، یک تترازول زرد رنگ است و در سلول های زنده، طی فرآیند کاهشی، به فرمازان بنفش کاهش می یابد. یک محلول حل کننده (به طور معمول متیل سولفوکسید – یک محلول اتانولی اسیدی – یا یک دترجنت – سدیم دودسیل سولفات در اسید کلریدریک رقیق شده –)  به آن اضافه می شود تا بلور های فرمازان بنفش نامحلول، در آن حل شده و محلول یکدست بنفش رنگی به دست آید.

میزان جذب این محلول رنگی را می توان با اندازه گیری در یک طول موج خاص (معمولاً بین 500 تا 600 نانومتر) توسط دستگاه اسپکتروفتومتر اندازه گیری کرد. میزان جذب نور به میزان غلظت بلور های فرمازان درون سلول و مساحت سلول بستگی دارد. هرچه غلظت فرمازان بیشتر باشد، رنگ بنفش شدید تر است که در نتیجه آن، میزان جذب نیز بیشتر می شود.

XTT (2،3-بیس- (2-متوکسی-4-نیترو-5-سولفوفنیل) -2H-تترازولیوم-5-کربوکسانیلید) جایگزینی برای نمک MTT پیشنهاد شده است، که از حساسیت دامنه دینامیکی بالاتری برخوردار است. بلور فرمازان تشکیل شده توسط این نمک، در آب حل می شود و  به همین دلیل از مرحله حل کردن بلور ها می توان چشم پوشی کرد.

نمک های تترازولیوم محلول در آب اخیرا به عنوان جایگزینی برای MTT استفاده می شوند.

MTS (3- (4،5-دی متیل تیازول-2-یل) -5- (3-کربوکسی ممتوکسی فنیل) -2- (4-سولفوفنیل) -2H-تترازولیوم)، در حضور متازولفات فنازین (PMS)، بلور فرمازانی راا تولید می کند که حداکثر جذب آن در 490 نانومتر در بافر فسفات سالین است. روش MTS اغلب به عنوان یک روش MTT “یک مرحله ای” توصیف می شود، که بدون نیاز به افزودن مراحل متناوب مورد نیاز در روش MTT، به راحتی، در یک واکنش مستقیم نتیجه را مشخص می کند.

با وجود راحتی این تست، روش MTS در معرض تداخلات رنگی قرار دارد. مراحل متناوب موجود در روش MTT رد ترکیبات رنگی را از بین می برد، در حالی که ترکیبات، در پلیت میکروتیتر یک مرجله ای در روش MTS باقی می مانند. برای اطمینان از دقت در هنگام استفاده از این روش، اقدامات احتیاطی لازم است و استدلال های محکمی برای تأیید نتایج MTS با استفاده از مشاهدات کیفی در زیر میکروسکوپ وجود دارد.

WST ها (نمک های تترازولیوم محلول در آب) مجموعه ای از رنگ های محلول در آب برای سنجش MTT هستند که برای ایجاد طیف های مختلفی از جذب در بلور های فرمازان کاربرد دارند. WST-1 و به ویژه WST-8 (2- (2-متوکسی-4-نیتروفنیل) -3- (4-نیتروفنیل) -5- (2،4-دی سولفوفنیل) -2H-تترازولیوم)، نسبت به MTT برتری دارند چرا که آن ها در خارج از سلول ها کاهش می یابند و به کمک واسطه ی الکترونی PMS، یک بلور فرمازان محلول در آب تولید می کنند.

نهایتا، می توان نتایج سنجش های WST را می توان مستقیماً خوانش کرد (برخلاف MTT که به مرحله انحلال نیاز دارد) همچنین سیگنال های موثر تری نسبت به MTT می دهد و نیز میزان سمیت سلول ها را کاهش می دهد.

همچنین بخوانید…

آزمایشگاه کشت سلول ژنیران

دوره کارآموزی کشت سلول ژنیران

خدمات کشت سلول آزمایشگاه ژنیران

بازید مجازی از ژنیران