فسفوپروتئومیکس چیست؟ چالش ها و پیشرفت ها

فهرست مطالب نمایش

فسفوپروتئومیکس چیست؟

فسفوپروتئومیکس نوع خاصی از پروتئومیکس است که پروتئین‌ها را با تغییر برگشت‌پذیر پس از ترجمه فسفوریلاسیون می‌کند. فسفوریلاسیون پپتید نقش حیاتی در فرآیندهای سلولی مانند تنظیم چرخه سلولی، انتقال سیگنال و هدف گیری پروتئین دارد.

اگرچه این امر برای فرآیندهای سلولی حائز اهمیت است، فسفوپپتیدها در فراوانی کمتری نسبت به پپتیدهای غیر فسفریله یافت می‌شوند. این بدان معناست که تکنیک‌هایی برای تشخیص و تعیین کمیت پپتیدهای غیر فسفریله شده باید برای فسفوپروتئومیکس تطبیق داده شوند.

آنالیز پایه فسفوپروتئومیکس

روش اصلی برای تجزیه و تحلیل در مقیاس بزرگ فسفوپپتیدها ابتدا شامل رمزگذاری SILAC سلول‌های کشت شده است. SILAC، برچسب‌گذاری ایزوتوپ پایدار توسط اسیدهای آمینه در کشت سلولی، برچسب‌گذاری افتراقی سلول‌های آماده برای طیف‌سنجی جرمی (MS) را فراهم می‌کند. این تکنیک مبتنی بر افزودن یک شکل “سنگین” و “سبک” از اسیدهای آمینه به پروتئین‌ها است.

دو جمعیت سلولی رشد می‌کنند که فقط در این که شکل «سنگین» یا «سبک» آمینو اسید ترکیب شده است، متفاوت هستند. طیف سنج جرمی جفت پپتیدهای شیمیایی یکسان را به دلیل تفاوت جرمی متمایز می‌کند. قبل از ورود به طیف‌ سنج جرمی، سلول‌ها تحریک، لیز و هضم آنزیمی می‌شوند.

جداسازی پپتیدها از طریق کروماتوگرافی تبادل یونی انجام می‌شود. مرحله نهایی غنی‌سازی فسفوپپتید قبل از تجزیه و تحلیل از طریق طیف‌سنجی جرمی برای مقابله با فراوانی کم فسفوپپتیدها انجام می‌شود.

تکنیک‌های مختلف غنی سازی فسفوپپتید در فسفوپروتئومیکس استفاده می‌شود. در مواردی که یک اسید آمینه فسفریله خاص جستجو می‌شود، می‌توان ازimmunoprecipitation برای غنی سازی فسفوپپتید استفاده کرد. این شامل استفاده از آنتی بادی‌های ایجاد شده علیه اسیدهای آمینه فسفریله شده است که پپتید را متصل و جدا می‌کند.

برای غنی‌سازی فسفوپپتید در مقیاس بزرگ، کروماتوگرافی ترکیبی فلز (IMAC) معمولاً در جایی که فسفوپپتیدها بر اساس میل آن‌ها برای یون‌های فلزی تثبیت شده روی رزین جامد جدا می‌شوند، استفاده می‌گردد.

کروماتوگرافی میل ترکیبی اکسید فلز (MOAC) نیز استفاده می‌شود که از یک ماتریس اکسید فلزی یا هیدروکسید تشکیل شده است و نیاز به لنگر انداختن رزین را از بین می‌برد. دی اکسید تیتانیوم به دلیل تمایل شناخته شده آن به ترکیبات آلی و توانایی حفظ فسفوپپتیدها در طول کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، یک انتخاب برای MOAC است.

چالش‌های فسفوپروتئومیکس

زمینه فسفوپروتئومیکس در حال حاضر به دلیل موارد زیر محدود است:

فراوانی کم پروتئین، در مقایسه با طیف وسیعی از سلول‌ها.
تاثیر استوکیومتری کسری که در فسفوریلاسیون یافت می‌شود.
اختلال در راندمان هضم در طول آماده سازی نمونه
از دست دادن فسفوپپتیدها در طول آماده سازی نمونه
اختلال در کارایی یونیزاسیون فسفوپپتید
اختلال در شناسایی توالی پپتیدی از طیف‌های MS/MS با کیفیت پایین، ناشی از رفتار گروه فسفات.
مشکلات ارزیابی محلی سازی سایت‌های فسفوریلاسیون.

شناسایی و تعیین کمیت محل فسفوپپتید دشوارتر از اندازه گیری پروتئین‌های غیر فسفریله است. فسفوریلاسیون یک فرآیند پویا است که مستعد خطا است، به این معنی که برخی از رویدادهای فسفوریلاسیون پروتئین بدون ارتباط عملکردی عمده رخ می‌دهد. هنگام مطالعه مقادیر بالایی از پروتئین‌ها، رویدادهای فسفوریلاسیون تصادفی به دلیل حساسیت بالای طیف سنج‌های جرمی مدرن گزارش می‌شود.

هنگامی که فسفوریلاسیون تصادفی روی پروتئین‌های با فراوانی بالا اتفاق می‌افتد، در شناسایی مکان‌های فسفوریلاسیون روی پروتئین‌های نادر مشکل بیشتری وجود دارد. یک راه حل بالقوه برای این مشکل، تشکیل پروفایل‌های زمانی برای فسفوریلاسیون پروتئین پس از درمان خاص است. این یک استراتژی برای تفسیر مقادیر زیادی از داده‌های فسفوپروتئومی ایجاد می‌کند.

پیشرفت در فسفوپروتئومیکس

پیشرفت در ابزار دقیق MS، غنی سازی فسفوپپتید، کروماتوگرافی پپتیدی و پروتئومیکس محاسباتی زمینه فسفوپروتئومیکس را افزایش داده است. کروماتوگرافی مایع نانوجریان- طیف سنجی جرمی پشت سر هم (LC-MS/MS) به طور خاص یک روش نوین برای شناسایی و تعیین کمیت فسفوریلاسیون پروتئین است.

اگرچه SILAC رایج‌ترین روش برچسب‌گذاری برای کمی‌سازی فسفوپپپتید LC-MS/MS است، روش‌های جایگزین مانند کمی‌سازی بدون برچسب (LFQ) و برچسب‌های جرمی پشت سر هم هم‌بار (مانندiTRAQ ، TMT) محبوبیت بیشتری دارند. LFQ از طریق مقایسه شدت سیگنال پپتید MS بین اجرای MS کار می‌کند به این معنی که برچسب ایزوتوپ پایدار مورد نیاز نیست.

برچسب‌های جرمی پشت سر هم ایزوباریک مزیتی نسبت به LFQ دارند که نیاز به اندازه گیری نمونه‌های جداگانه دارد. هر دو iTRAQ و TMT می‌توانند به طور همزمان تا یازده نمونه را در رویکردی به نام Multiplexing اندازه گیری کنند. انتخاب تکنیک‌های کمی‌سازی به استفاده آن بستگی دارد، با SILAC و LFQ دقت بیشتری را در مقایسه با گونه‌های مختلط با نسبت‌های ثابت فسفوپپتید ارائه می‌کنند. در حالی که الگوریتم‌های تعیین مکان‌های فسفوریلاسیون با مالتیپلکس کردن بهبود می‌یابند.

همچنین بخوانید:

مترجم: شقایق مرتاضی
منبع

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه