رنگ آمیزی تریکروم ویتلی: تعریف، اصول، روش و تفسیر نتایج

فهرست مطالب نمایش

رنگ آمیزی تریکروم ویتلی چیست؟

تکنیک رنگ آمیزی تریکروم ویتلی یک رنگ پایدار ویژه است که در انگل‌شناسی برای تشخیص و شناسایی تک‌یاخته‌های روده در نمونه‌های مدفوع استفاده می‌شود.

رنگ آمیزی تریکروم بر روی نمونه مدفوع تثبیت شده با PVA یا نگه‌داری شده با روش Schaudinn انجام می‌شود.
مورفولوژی تک‌یاخته‌های شناسایی شده به صورت کیست‌ها (Cyst) و تروفوزوئیت‌ها (Trophozoite) شناخته شده است.
Gomori این رنگ را در سال 1951 ایجاد کرد و بعدا در سال 1952 توسط Wheatley اصلاح شد و مراحل تثبیت کننده و هیدراتاسیون (Hydration) را به روش اولیه اضافه کرد و یک تکنیک رنگ آمیزی سریع و در عین حال ساده برای آمیب‌ها و تاژک‌داران روده ایجاد کرد.

اصول رنگ آمیزی تریکروم ویتلی

در روش رنگ آمیزی تریکروم ویتلی از نمونه‌های مدفوع یا فیلم مدفوع استفاده می‌شود که برای تسهیل تشخیص و شناسایی کیست‌ها و تروفوزوئیت‌ها به‌طور دائمی رنگ آمیزی می‌شوند. این روش بسیار حساس است، از این رو می‌تواند تک‌یاخته‌های کوچکی را که در طول معاینه از قلم افتاده‌اند، شناسایی کند. رنگ تریکروم ویتلی یک رنگ اصلاح شده از روش اصلی بافت Gomori است.

این تکنیک یک پروسه ساده دارد که به سرعت انجام می‌شود. این روش اسمیرهای به صورت یکنواخت رنگ آمیزی شده‌ای از تک‌یاخته‌های روده‌ای، مخمرها، مصنوعات و سلول‌های انسانی تولید می‌کند. نمونه مدفوع مورد استفاده باید تازه باشد، یا در پلی‌وینیل الکل (Polyvinyl alcohol (PVA)) تثبیت یا در سدیم استات- استیک اسید- فرمالین (sodium acetate-acetic acid-formalin (SAF)) نگه‌داری شده باشد.

آماده‌سازی شناسگرها

تریکروم (فرمولاسیون ویتلی)
- کروموتروپ 2R، به مقدار 6 گرم
- لایت گرین SF، به مقدار 0.3 گرم
- اسید فسفوتنگستیک 0.7 گرم
- اسید استیک گلاسیال 1.0 میلی لیتر
- آب مقطر 100 میلی‌لیتر
- 1 میلی‌لیتر اسید استیک به اجزای خشک اضافه کرده و اجازه دهید به مدت 3 دقیقه در دمای اتاق بماند. سپس 100 میلی‌لیتر آب مقطر اضافه کنیدتا رنگ محلول به بنفش تغییر کند. محلول باید از نور محافظت شده و در یک بطری شیشه‌ای یا پلاستیکی در دمای اتاق نگه‌داری شود. ماندگاری محلول 24 ماه است.
- اتانول 70% بعلاوه ید: برای تهیه محلول ذخیره، کریستال‌های ید را به الکل 70% اضافه کنید تا محلولی تیره بدست آید ((1 تا 2 گرم در 100 میلی‌لیتر). برای استفاده، محلول ذخیره را با الکل 70 درصد رقیق کنید تا رنگ قهوه‌ای مایل به قرمز تیره یا رنگ چای پر رنگ به دست آید.
- اتانول 70%
- اتانول اسیدی 90%: با مخلوط کردن 99.5 میلی‌لیتر اتانول با 0.5 میلی‌لیتر اسید استیک گلاسیال تهیه می‌شود.
- اتانول 95%
- اتانول 100%
- زایلن (Xylene) یا جایگزین زایلن
- محیط مانتینگ (Mounting medium) (Permount)
- روغن ایمرسیون (Immersion oil)

روش رنگ آمیزی تریکروم ویتلی

توجه: هنگام اجرای رنگ آمیزی تریکروم ویتلی دستکش بپوشید.

آماده‌سازی مدفوع

نمونه مدفوع تازه را آماده کنید. نمونه‌های کوچکی از مدفوع را با استفاده از اپلیکاتور (Applicator stick) روی لام‌های میکروسکوپی استریل تمیز قرار دهید تا اسمیرهای بسیار نازکی از نمونه ایجاد کنید.
نمونه را خشک نکنید و بلافاصله اسلایدها را در فیکساتور Schaudinn قرار داده و اجازه دهید برای 30 دقیقه تثبیت شود. اگر نمونه مدفوع آبکی است، 3 یا 4 قطره PVA را روی اسمیر لام (لام با یک نمونه مدفوع) اضافه کنید و خوب مخلوط کنید و بگذارید چند ساعت در دمای 35 تا 37 درجه سانتی‌گراد یا یک شب در دمای اتاق بماند تا خشک شود.

رنگ آمیزی اسمیرها

توجه: برای آماده سازی اسمیر PVA، آن را به مدت 10 دقیقه در محلول ید- الکل (اتانول 70٪ به اضافه ید) قرار دهید. برای نمونه‌های دیگر با فیکساتورهای مختلف بدون کلرید جیوه (Mercuric chloride)، مرحله ید را حذف کنید.

لام را از فیکساتور Schaudinn برداشته و آن را به مدت 5 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را برای نمونه‌های مدفوع تازه به مدت یک دقیقه یا برای نمونه‌های خشک شده با هوای نگه‌داری شده با PVA به مدت 5 تا 10 دقیقه در اتانول 70 درصد به اضافه ید قرار دهید.
لام را به مدت 5 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را به مدت 3 دقیقه در اتانول 70 درصد قرار دهید.
لام را به مدت 10 دقیقه در رنگ تریکروم قرار دهید.
لام را در اتانول 90 درصد قرار دهید و اسید استیک را به مدت 1 تا 3 ثانیه اضافه کنید و بلافاصله قفسه را آبکشی کنید و به مرحله بعد بروید. اجازه ندهید اسلاید در این محلول باقی بماند.
لام حاوی اسمیر را در اتانول 100% فرو ببرید. این مرحله، مرحله آبکشی است.
لام را در دو تعویض از اتانول 100% به مدت 3 دقیقه برای هر تعویض قرار دهید.
آن را به مدت 5 تا 10 دقیقه در زایلن قرار دهید.
اسمیر را با یک لامل با استفاده از یک محیط مانتینگ مانند پرمونت (permount) به عمل آورید.
اجازه دهید اسمیر یک شب یا حداقل 1 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‌گراد بماند تا خشک شود.
اسمیر را به صورت میکروسکوپی با بزرگ‌نمایی 100 برابر بررسی کنید. نمونه را با میکروسکوپ روغن ایمرسیون با بزرگ‌نمایی 200 تا 300 برابری بررسی کنید.

نتایج و تفسیر رنگ آمیزی تریکروم ویتلی

تروفوزوئیت‌ها و کیست‌های تک‌یاخته‌ای را بررسی کنید.
سیتوپلاسم تروفوزوئیت‌های تک‌یاخته‌ای به رنگ آبی- سبز یا بنفش روشن رنگ می‌شود.
کیست‌ها بیشتر ارغوانی به نظر می‌رسند.
وجود مخمر و سلول‌های انسانی مانند گلبول‌های قرمز خون، سلول‌های پلی‌مورفونوکلئر (PolyMorphonuclear cells (PMNs)) و ماکروفاژها (Macrophage) را می‌توان شناسایی کرد. آن‌ها به رنگ قرمز درمی‌آیند.
هسته‌ها و اجسام انکلوژنی (Inclusion body) نیز به رنگ بنفش کم‌رنگ درمی‌آیند.
پس زمینه سبز رنگ می‌شود که کنتراست زیادی با تک‌یاخته‌ها از خود نشان می‌دهد.
مولکول‌های گلیکوژن (Glycogen) توسط حلال‌های رنگ، حل می‌شوند و مانند ارگانیسم شفاف به نظر می‌رسند.

محدودیت‌های رنگ آمیزی تریکروم ویتلی

تخم‌ها و لاروهای هلمینت (Helminth) را نمی‌توان به طور دائم توسط رنگ تریکروم ویتلی رنگ آمیزی کرد.
برای شناسایی و بررسی تک‌یاخته‌ها، مشاهده رنگ نیاز به بزرگ‌نمایی بالا زیر لنز روغن ایمرسیون دارد و ممکن است برخی از مورفولوژی‌های تک یاخته‌ها از قلم بیافتد.
برخی از تک‌یاخته‌ها را نمی‌توان با استفاده از رنگ آمیزی تریکروم ویتلی شناسایی کرد مانند: کریپتوسپوریدیوم پارووم (Cryptosporidium parvum) و سیکلوسپورا کایتاننسیس (Cyclospora cayetanensis).
اسپورهای میکروسپوریدیا (Microsporidia) را نمی‌توان با استفاده از اسمیر رنگ آمیزی شده با تریکروم ویتلی مشاهده کرد.