وکتور pBR322: تعریف، ساختار، سایت‌ها و کاربردها

وکتور pBR322 چیست؟

وکتور pBR322 چیست؟

pBR322 یک وکتور کلونینگ (Cloning vector) رایج در اشریشیا کلی (E. coli) است و کاربردهای فوق العاده‌ای در کلونینگ دارد.

فرم کامل pBR322:

  1. p = پلاسمید
  2. B = Bolivar
  3. R= Rodriguez
  4. 322 = نام عددی
  • وکتور pBR322 در سال 1977 در آزمایشگاه Herbert Boyer در دانشگاه کالیفرنیا، سانفرانسیسکو ساخته شد.
  • این وکتور یک پلاسمید سنتتیک (Synthetic) است و اولین پلاسمید مصنوعی بود که ساخته و به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده شد.
  • pBR322 یکی از پلاسمیدهایی است که بیشترین مطالعه روی آن انجام شده است.
  • طول آن 4362 جفت باز (Base pair) است.
  • به طور کامل توالی‌یابی شده است، یعنی کل توالی pBR322 شناخته شده و مورد مطالعه قرار گرفته است.
  • وزن مولکولی آن 106 83 دالتون (Dalton) است.

ساختار وکتور pBR322

  • مبدا همانندسازی
  • سایت‌های محدود کننده آنزیم
  • سایت‌های نشانگر قابل انتخاب

مبدا همانندسازی

  • مبدا همانندسازی در پلاسمید pBR322 به عنوان pMB1 شناخته می‌شود.
  • تعداد کپی این پلاسمید 15 تا 20 می‌باشد.

سایت‌های محدود کننده آنزیم

  • حدود 40 سایت محدود کننده مختلف روی ژنوم pBR322 وجود دارد.
  • تقریباً 11 محل محدود کننده مختلف در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین (Tetracycline) وجود دارد.
  • در ناحیه مقاوم به آمپی‌سیلین (Ampicillin)، 9 سایت محدود کننده آنزیم‌های مختلف وجود دارد.
  • برخی از سایت‌های شناخته شده محدود کننده آنزیم عبارتند از: BamHI، HindIII، EcoRI، SaII و بسیاری دیگر.
نقشه وکتور PBR322
نقشه وکتور pBR322

سایت‌های نشانگر قابل انتخاب

دو سایت نشانگر قابل انتخاب یا ژن مقاوم در برابر آنتی‌بیوتیک، روی ژنوم این پلاسمید وجود دارد.

  • سایت مقاوم به آمپی‌سیلین: ژن آمپی‌سیلین برای بتالاکتاماز کدگذاری می‌کند، که می‌تواند برای غربالگری میکروارگانیسم‌ها زمانی که یک DNA خارجی وارد پلاسمید می‌شود، استفاده شود.
  • سایت مقاوم به تتراسایکلین: این ژن، آنتی‎بیوتیک تتراسایکلین را تجزیه می‌کند و می‌تواند برای غربالگری میکروارگانیسم‌ها استفاده شود.
  • این ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک در غربالگری ارگانیسم‌ها پس از شبیه‌سازی مفید هستند.

غربالگری نوترکیب‌های حاوی pBR322

pBR322

  • در نظر بگیرید که از آنزیم محدود کننده BamHI برای برش پلاسمید در آن موقعیت خاص استفاده می‌شود.
  • BamHI در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین مربوط به پلاسمید pBR322 قرار دارد.
  • اکنون، مولکول نوترکیب pBR322 که شامل مولکول DNA تازه وارد شده است، به تتراسایکلین حساس خواهد بود.
  • اما این مولکول نوترکیب نسبت به آمپی‌سیلین مقاوم است، زیرا ژن مقاوم به آمپی‌سیلین کاملاً در حال عمل کردن می‌باشد.
  • از این رو سلول‌های نوترکیب روی محیط حاوی آمپی‌سیلین قرار می‌گیرند و انکوبه می‌شوند.
  • کلنی‌هایی که روی پلیت‌های حاوی محیط دارای آمپی‌سیلین ظاهر می‌شوند، کلنی‌های تبدیل‌شده حاوی سلول‌هایی با مولکول DNA تازه وارد شده، هستند.
  • برای تایید کلنی‌های تبدیل شده از تکنیک پلیت‌های همانند (Replica plate) استفاده می‌شود.
  • برای تأیید این‌که کلنی‌های روی محیط‌های حاوی آمپی‌سیلین، کلنی‌های تبدیل‌شده هستند، روی پلیت‌های حاوی محیطی شامل تتراسایکلین قرار می‌گیرند.
  • کلنی‌هایی که در محیط شامل تتراسایکلین رشد نمی‌کنند، کلنی‌های تبدیل‌شده هستند، زیرا کلنی‌های تبدیل‌شده به تتراسایکلین حساس هستند.

مزایای وکتور pBR322

  • با توجه به اندازه قابل کنترل آن، پلاسمید pBR322 به طور گسترده‌ای به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده می‌شود.
  • وجود دو ژن مقاوم به آنتی‌بیوتیک، فرآیند انتخاب نوترکیب‌ها را تسهیل می‌کند.
  • چند سایت محدود کننده آنزیم، پلاسمید را از بسیاری جهات سازگار می‌کند.
  • pBR322 تعداد کپی بالایی دارد که در مهندسی ژنتیک بسیار مطلوب است.

معایب وکتور pBR322

  • شناسایی سلول‌های نوترکیب دارای مولکول DNA تازه وارد شده، زمان‌بر است.

مطالب مرتبط با وکتور pBR322:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

1 / 5. تعداد رای دهندگان: 1

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *