فهرست مطالب
نمایش
وکتور pBR322 چیست؟
pBR322 یک وکتور کلونینگ (Cloning vector) رایج در اشریشیا کلی (E. coli) است و کاربردهای فوق العادهای در کلونینگ دارد.
فرم کامل pBR322:
- p = پلاسمید
- B = Bolivar
- R= Rodriguez
- 322 = نام عددی
- وکتور pBR322 در سال 1977 در آزمایشگاه Herbert Boyer در دانشگاه کالیفرنیا، سانفرانسیسکو ساخته شد.
- این وکتور یک پلاسمید سنتتیک (Synthetic) است و اولین پلاسمید مصنوعی بود که ساخته و به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده شد.
- pBR322 یکی از پلاسمیدهایی است که بیشترین مطالعه روی آن انجام شده است.
- طول آن 4362 جفت باز (Base pair) است.
- به طور کامل توالییابی شده است، یعنی کل توالی pBR322 شناخته شده و مورد مطالعه قرار گرفته است.
- وزن مولکولی آن 106 83 دالتون (Dalton) است.
ساختار وکتور pBR322
- مبدا همانندسازی
- سایتهای محدود کننده آنزیم
- سایتهای نشانگر قابل انتخاب
مبدا همانندسازی
- مبدا همانندسازی در پلاسمید pBR322 به عنوان pMB1 شناخته میشود.
- تعداد کپی این پلاسمید 15 تا 20 میباشد.
سایتهای محدود کننده آنزیم
- حدود 40 سایت محدود کننده مختلف روی ژنوم pBR322 وجود دارد.
- تقریباً 11 محل محدود کننده مختلف در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین (Tetracycline) وجود دارد.
- در ناحیه مقاوم به آمپیسیلین (Ampicillin)، 9 سایت محدود کننده آنزیمهای مختلف وجود دارد.
- برخی از سایتهای شناخته شده محدود کننده آنزیم عبارتند از: BamHI، HindIII، EcoRI، SaII و بسیاری دیگر.
سایتهای نشانگر قابل انتخاب
دو سایت نشانگر قابل انتخاب یا ژن مقاوم در برابر آنتیبیوتیک، روی ژنوم این پلاسمید وجود دارد.
- سایت مقاوم به آمپیسیلین: ژن آمپیسیلین برای بتالاکتاماز کدگذاری میکند، که میتواند برای غربالگری میکروارگانیسمها زمانی که یک DNA خارجی وارد پلاسمید میشود، استفاده شود.
- سایت مقاوم به تتراسایکلین: این ژن، آنتیبیوتیک تتراسایکلین را تجزیه میکند و میتواند برای غربالگری میکروارگانیسمها استفاده شود.
- این ژنهای مقاوم به آنتیبیوتیک در غربالگری ارگانیسمها پس از شبیهسازی مفید هستند.
غربالگری نوترکیبهای حاوی pBR322
- در نظر بگیرید که از آنزیم محدود کننده BamHI برای برش پلاسمید در آن موقعیت خاص استفاده میشود.
- BamHI در ناحیه مقاوم به تتراسایکلین مربوط به پلاسمید pBR322 قرار دارد.
- اکنون، مولکول نوترکیب pBR322 که شامل مولکول DNA تازه وارد شده است، به تتراسایکلین حساس خواهد بود.
- اما این مولکول نوترکیب نسبت به آمپیسیلین مقاوم است، زیرا ژن مقاوم به آمپیسیلین کاملاً در حال عمل کردن میباشد.
- از این رو سلولهای نوترکیب روی محیط حاوی آمپیسیلین قرار میگیرند و انکوبه میشوند.
- کلنیهایی که روی پلیتهای حاوی محیط دارای آمپیسیلین ظاهر میشوند، کلنیهای تبدیلشده حاوی سلولهایی با مولکول DNA تازه وارد شده، هستند.
- برای تایید کلنیهای تبدیل شده از تکنیک پلیتهای همانند (Replica plate) استفاده میشود.
- برای تأیید اینکه کلنیهای روی محیطهای حاوی آمپیسیلین، کلنیهای تبدیلشده هستند، روی پلیتهای حاوی محیطی شامل تتراسایکلین قرار میگیرند.
- کلنیهایی که در محیط شامل تتراسایکلین رشد نمیکنند، کلنیهای تبدیلشده هستند، زیرا کلنیهای تبدیلشده به تتراسایکلین حساس هستند.
مزایای وکتور pBR322
- با توجه به اندازه قابل کنترل آن، پلاسمید pBR322 به طور گستردهای به عنوان یک وکتور کلونینگ استفاده میشود.
- وجود دو ژن مقاوم به آنتیبیوتیک، فرآیند انتخاب نوترکیبها را تسهیل میکند.
- چند سایت محدود کننده آنزیم، پلاسمید را از بسیاری جهات سازگار میکند.
- pBR322 تعداد کپی بالایی دارد که در مهندسی ژنتیک بسیار مطلوب است.
معایب وکتور pBR322
- شناسایی سلولهای نوترکیب دارای مولکول DNA تازه وارد شده، زمانبر است.
مطالب مرتبط با وکتور pBR322:
- پلاسمید چیست؟
- وکتور یا ناقل چیست؟
- آماده سازی وکتور برای کلونینگ ژن
- وکتورهای کلونینگ چیست؟ تعریف، ویژگی، انواع و کاربرد
- وکتور pUC19: تعریف، ساختار، سایتها و کاربردها
مترجم: صادق حسینیکیا