مقدمهای بر هاروست در سیتوژنتیک
سیتوژنتیک شاخهای از علم ژنتیک است که به مطالعه ساختار و عملکرد کروموزومها میپردازد. یکی از حیاتیترین مراحل در تجزیه و تحلیل سیتوژنتیک، برداشت (هاروست) است که شامل جمع آوری، پردازش و آمادهسازی سلولها برای آنالیز کروموزومی است. موفقیت تکنیکهایی مانند کاریوتایپ، هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH)، کاریوتایپ طیفی (SKY) و هیبریداسیون ژنومی مقایسهای (CGH) به یک فرآیند برداشت کارآمد و بهینه بستگی دارد.
هاروست در سیتوژنتیک شامل چندین مرحله ضروری مانند کشت سلولی، توقف میتوزی، تیمار با هیپوتونیک، تثبیت و آمادهسازی لام میباشد. هدف به دست آوردن گستره متافازی با کیفیت بالا و تضمین ایجاد تصویر واضح از ساختارها و ناهنجاریهای کروموزومی است.
این مقاله مروری عمیق بر روشهای هاروست در سیتوژنتیک، جزئیات هر مرحله، مواد مورد نیاز، استراتژیهای عیبیابی و کاربردها در زمینههای پزشکی و تحقیقاتی ارائه میکند.
اصل هاروست سیتوژنتیک
هاروست سیتوژنتیک شامل پردازش سلولهای در حال تقسیم برای به دست آوردن کروموزومها در متافاز است. این فرآیند شامل مراحل اصلی زیر است:
- کشت سلولی– رشد سلولها برای به دست آوردن جمعیتهای سلولی فعالانه در حال تقسیم.
- توقف میتوزی– استفاده از کلشیسین یا کلسمید برای توقف تقسیم سلولی در متافاز.
- درمان هیپوتونیک– متورم کردن سلول ها برای گسترش کروموزوم ها از هم.
- تثبیت– حفظ ساختار کروموزومی با استفاده از متانول استیک اسید.
- آماده سازی اسلاید– ریختن سوسپانسیون های سلولی روی اسلایدها برای تجسم کروموزوم.
مواد و تجهیزات مورد نیاز
الف. معرف ها و مواد شیمیایی
-
- کلسمید یا کلشیسین– سلولها را در متافاز متوقف میکند.
- محلول هیپوتونیک (0.075M KCl)– سلولها را برای گسترش کروموزومها متورم میکند.
- تثبیت کننده (متانول: اسید استیک، 1:3)– مورفولوژی کروموزوم را حفظ میکند.
- PBS یا محیط کشت– زنده ماندن و سلول را در طول پردازش حفظ میکند.
ب. تجهیزات
- انکوباتور (37 درجه سانتیگراد، 5% CO2)– برای حفظ کشت سلولی.
- سانتریفیوژ– برای تهنشین شدن و شستشوی سلولها.
- حمام آب (37 درجه سانتی گراد)– برای درمان هیپوتونیک استفاده میشود.
- میکروسکوپ– برای بررسی گسترش کروموزوم.
- لام و لامل– برای رنگ آمیزی سیتوژنتیک.
انواع نمونههای مورد استفاده در سیتوژنتیک
هاروست سیتوژنتیکی را میتوان بر روی انواع مختلف نمونه انجام داد:
- لنفوسیتهای خون محیطی– برای کاریوتایپ روتین استفاده میشود.
- سلولهای مغز استخوان– برای تشخیص لوسمی و لنفوم ضروری است.
- سلولهای مایع آمنیوتیک– برای تجزیه و تحلیل کروموزومی قبل از تولد انجام میشود.
- نمونه پرزهای کوریونی (CVS)– در غربالگری اولیه قبل از تولد استفاده میشود.
- سلولهای تومور– برای تشخیص ناهنجاریهای کروموزومی در سرطان.
- کشتهای فیبروبلاست– برای سندرمهای ژنتیکی و مطالعات موزائیسم استفاده میشود.
روش گام به گام برای هاروست سیتوژنتیکی
مرحله 1: آماده سازی کشت سلولی
- نمونه برداری (خون، مایع آمنیوتیک، مغز استخوان یا بیوپسی بافت).
- انتقال سلولها به محیط کشت (RPMI-1640 یا DMEM) حاوی مکملهای زیر:
- سرم جنین گاوی (FBS، 10-20%).
- میتوژن (به عنوان مثال، PHA برای لنفوسیت ها برای تحریک تقسیم).
- انکوبه کردن کشتها در دمای 37 درجه سانتی گراد با CO2 5% به مدت 48 تا 72 ساعت.
مرحله 2: دستگیری میتوتیک با کلسمید (Colcemid)
- کلسمید (غلظت نهایی: 0.05-0.1 میکروگرم در میلی لیتر) را برای توقف سلولها در متافاز اضافه کنید.
- قبل از برداشت 1 تا 3 ساعت انکوبه کنید.
- با بررسی یک قطره کشت زیر میکروسکوپ، شاخص میتوزی را بررسی کنید.
عیب یابی:
- پایین بودن شاخص میتوزیک← زمان انکوباسیون کلسمید را افزایش دهید.
- کروموزومهای بیش از حد متراکم ← کاهش غلظت کلسمید
مرحله 3: تریت هیپوتونیک
- کشت را با دور rpm1000 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را دور بریزید.
- محلول هیپوتونیک 075M KCl را به صورت قطرهای به سلولها اضافه کنید.
- در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه انکوبه کنید تا کروموزوم متورم شود.
- محلول هیپوتونیک را سانتریفیوژ کرده و خارج کنید.
عیب یابی:
- گسترش ضعیف کروموزوم ← انکوباسیون هیپوتونیک را افزایش دهید.
- لیز شدن بیش از اندازه سلولها← زمان انکوباسیون را کاهش دهید
مرحله 4: تثبیت (فیکساسیون)
- همراه با ورتکس کردن، فیکساتور متانول-اسید استیک تازه آماده شده (نسبت 1:3) را به صورت قطرهای اضافه کنید.
- به مدت 10 تا 15 دقیقه روی یخ قرار دهید.
- فیکساسیون را 3 بار تکرار کنید تا محلول هیپوتونیک باقیمانده از بین برود.
عیب یابی:
- کدر بودن سوسپانسیون← دفعات تثبیت را افزایش دهید.
- رسوب جامد سلولی (کلامپ سلولی)← بین مراحل فیکساتیو، رسوب را به آرامی حل کنید.
مرحله 5: آماده سازی لام
- سوسپانسیون را روی یک لام شیشه ای از قبل تمیز شده با زاویه 45 درجه بیندازید.
- اجازه دهید لام در دمای اتاق با جریان عادی هوا خشک شود.
- با میکروسکوپ حضور کروموزومها با گستردگی خوب را بررسی کنید.
عیب یابی:
- همپوشانی کروموزومها← رطوبت یا دمای خشک کردن لام را تغییر دهید.
- رنگ آمیزی ضعیف کروموزوم ؟ ← از تثبیت مناسب اطمینان حاصل کنید.
مرحله 6: نواربندی و رنگ آمیزی کروموزوم
پس از برداشت، لامها برای تجزیه و تحلیل سیتوژنتیک با استفاده از تکنیکهای مختلف رنگ آمیزی آماده میشوند:
الف. بندینگ با رنگ گیمسا (G-Banding)
- پرکاربردترین تکنیک کاریوتایپینگ است.
- لام هارا با تریپسین تیمار کنید تا پروتئینها تا حدی هضم شوند.
- برای تولید الگوهای نواری مشخص، با Giemsa رنگ آمیزی کنید.
ب. هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH)
- از پروبهای فلورسنت برای تشخیص ناهنجاریهای کروموزومی خاص استفاده میشود.
- برای تشخیص ریزحذف ها و آنوپلوئیدی (به عنوان مثال، تریزومی 21) مفید است.
ج. کاریوتایپ طیفی (SKY)
- از پروبهای فلورسنت متعدد برای تجسم کل مجموعههای کروموزوم استفاده میشود.
ت. هیبریداسیون مقایسه ای ژنومی (CGH)
- تشخیص تکثیر و حذف کروموزومی بدون کشت سلولی.
کاربردهای برداشت یا هاروست سیتوژنتیک
- غربالگری پیش از تولد– نشانگان داون (تریزومی 21)، سندرم ترنر(45,X) و سندرم کلاین فلتر (47,XXY) را تشخیص میدهد.
- سیتوژنتیک سرطان– جابجاییهای کروموزومی در لوسمی و لنفوم را شناسایی می کند (به عنوان مثال،t(9;22) در CML).
- تشخیص ناباروری– ناهنجاریهای ساختاری کروموزومی را که منجر به سقط جنین می شود، شناسایی میکند.
- تشخیص سندرم ژنتیکی- نقایص کروموزومی را در سندرمهای آنجلمن، پرادر-ویلی و ویلیامز تشخیص می دهد.
- فارماکوژنومیک و تحقیقات دارویی- به درمانهای هدفمند بر اساس جهشهای کروموزومی کمک میکند.
چالش ها و محدودیت های هاروست در سیتوژنتیک
- مسائل بروز آلودگی– شرایط اسپتیک و استریل باید به خوبی رعایت شود.
- شاخص میتوزی پایین– برخی از نمونهها (به عنوان مثال، سلول های تومور) دارای نرخ تقسیم پایین هستند.
- انتشار ضعیف کروموزوم– رطوبت و آمادهسازی لام میتواند بر نتایج تأثیر بگذارد.
- زمان پردازش طولانی– برداشت 48-72 ساعت طول میکشد و تشخیص سریع را محدود میکند.
نتیجه گیری
هاروست در سیتوژنتیک یک مرحله حیاتی است که کیفیت آنالیز کروموزومی را تعیین میکند. اجرای مناسب کشت سلولی، توقف میتوزی، تورژسانس با هیپوتونیک، تثبیت و آماده سازی اسلاید برای کاریوتایپ موفق و سیتوژنتیک مولکولی ضروری است.
با پیشرفت در سیتوژنتیک خودکار، کاریوتایپ دیجیتال و توالی یابی نسل بعدی، برداشت سیتوژنتیک سنگ بنای تشخیص ژنتیک، انکولوژی و پزشکی شخصی شده باقی میماند
آیا تاخیر یا عدم شرکت در دوره ها حذفی هم داره؟ یا فقط باعث عقب موندن از دوره میشه؟
سلام اگر 20% کلاس ها رو نباشید حذف میشید
ازلاعات در زمینه DNA تکمیل بوده و مرحله به مرحله توضیح کامل داشتند
سلام مرسی از نظرتون