آنالیز Sanger Sequencing چیست؟

آنالیز Sanger Sequencing

تعیین توالی DNA از اساسی ترین تکنیک های موجود در زمینه علم زیست شناسی مولکولی است که در زمینه های تشخیص طبی، نانوتکنولوژی، بیوانفورماتیک و در زمینه های میکروبیولوژی از اهمیت خاصی برخوردار است. در اینجا مختصری در مورد توالی یابی سنگر توضیح خواهیم داد.

این تکنیک بواسطه سنگر و همکارانش در اواسط ۱۹۷۰ ابداع گردید. تکنیک سنگر که با نام خاتمه زنجیره DNA نیز شناخته می شود بر مبنای خاتمه رشته دی اکسی نوکلئیک اسید توسط DNA پلی مراز عمل می کند که از نوکلئوتید های ویژه ای به نام ddNTPs (dideoxynucleotids) استفاده می کند که فاقد گروه OH بر روی کربن ۳ هستند و اگر در ساختار یک اسید نوکلئیک قرار گیرند، سنتز این زنجیره خاتمه یافته و دیگر بلندتر نخواهد شد. این نوکلئوتیدها با مواد رادیواکتیو برچسب گذاری می شوند. در این روش به یک DNA تک رشته ای به عنوان الگو نیاز داریم. چهار لوله آزمایش مختلف برمیداریم و همه ی مواد مورد نیاز برای همانندسازی را به داخل هر چهار لوله اضافه می کنیم. در هر لوله آزمایش علاوه بر نوکلئوتیدهای طبیعی (dNTP)، یک نوع ddNTP خاص قرار داده می شود. از آنجایی که نسبت مقادیر نوکلئوتیدهای طبیعی (dNTP) بیشتر از ddNTP است و آنزیم پلیمراز، ddNTP ها را بطور تصادفی به زنجیره در حال ساخت اضافه می کند، در نتیجه محصول هر لوله ی آزمایش قطعاتی با اندازه های مختلف است که هر محصول به یک ddNTP خاص موجود در آن لوله ختم می شود. در نهایت این قطعات با الکتروفورز مویین از همدیگر تفکیک می شوند یا بر روی ژل آکریل آمید ران می شود که از طریق اتورادیوگراف بر روی ژل ظاهر می شوند. برای بدست آوردن توالی DNA، ddNTP های موجود در انتهای قطعات از پایین به بالا خوانده می شود و مکمل آنها نوشته می شود که مشابه با توالی قطعه مورد نظر می باشد.