ROX که با نام کربوکسی رودامین نیز شناخته می شود، یک رنگ فلورسنت بی اثر است که می تواند به ترکیب اصلی در qPCR یا PCR کمی اضافه شود. برخلاف دیگر رنگ های گزارشگر در qPCR (به عنوان مثال SYBR Green)، از ROX به عنوان یک رنگ غیرفعال یاد می شود، زیرا سیگنال فلورسانس آن تحت تأثیر واکنش های PCR نیست. به عبارت دیگر، سیگنال فلورسنت این رنگ در تمام مراحل qPCR پایدار می ماند و به میزان الگوی واکنش ربطی ندارد.
نقش ROX در qPCR
از آنجا که ROX یک رنگ فلورسنت منفعل است، دلیل اصلی استفاده از آن در qPCR نرمالیزاسیون سیگنال ها است. با نرمال سازی سیگنال فلورسنت از تنوع بین تکرارها کاسته می شود.
تغییرات جزئی بین چاهک های نمونه می تواند سیگنال فلورسنت تولید شده در qPCR را تحت تأثیر قرار دهد. به عنوان مثال، اختلاف در میزان واکنش به دلیل خطاهای پیپتینگ می تواند نتایج را مغرضانه جلوه دهد. همچنین، مواردی دیگر نظیر اپتیک دستگاه نیز می توانند بر سیگنال فلورسنت تولید شده تأثیر بگذارد. نحوه عملکرد ROX مشابه زمانی است که از ژن رفرنس به صورت Delta-Delta Ct استفاده می شود.
برای عادی سازی سیگنال فلورسنت، سیگنال رنگreporter بر سیگنال ROX تقسیم می شود. سپس مقدار جدید به عنوان reporter نرمال شده (Rn) گزارش می شود.
به طور معمول، در نمودار amplification، دلتا (Δ) Rn در محور y و تعداد سیکل ها در محور x قرار می گیرد. ΔRn تفاوت بین Rn هر نمونه آزمایشی و Rn پایه است. بنابراین، فقط نتایج بالاتر از سیگنال پایه / پس زمینه رسم می شوند.
آیا استفاده از ROX برای qPCR ضروری است؟
خیر. لازم نیست همواره ROX را به مخلوط qPCR خود اضافه کنید. با این حال، افزودن آن می تواند به کاهش تغییرات به وجود آمده در مقادیر فلورسنت در نمونه ها کمک کند، که نهایتا بر نتایج بیان ژن تأثیر گذار است.
