سیستم توالی یابی Roche 454

سیستم توالی یابی Roche 454 اولین پلتفرم تجاری شده فناوری توالی یابی نسل بعدی است. اصول این توالی یابی به شرح زیراست:

1. تهیه کتابخانه DNA

تهیه کتابخانه DNA در سیستم توالی 454 Roche با Illumina متفاوت است. در ابتدا از روش های متفاوتی برای شکستن نمونه‌های DNA به قطعات کوچک 300-800 جفت بازی استفاده می‌کنند و آداپتورهای متفاوتی را در هر دو انتها قطعات ایجاد شده، متصل می‌کند. در ادامه ، پس از دناتوره شدن DNAاز پرایمرها برای تکثیر استفاده  می‌شود ، کلون کردن در وکتورهای مشخص و در نهایت ساخت کتابخانه DNA تک رشته ای مراحل بعدی خواهند بود.

1. امولسیون PCR:

فرآیند تکثیر DNA سیستم Roche 454 با Illumina متفاوت است. DNAهای تک رشته ای بر روی بید‌های 28 میکرومتری ثابت می‌شوند. این بید‌ها در فضایی امولسیونی قرار دارند.

بزرگترین ویژگی امولسیون PCR، تشکیل تعداد زیادی فضای واکنش مستقل از هم جهت تکثیر DNA است. مراحل این فرایند به این صورت است که قبل از تکثیر DNA نمونه، محلول آبی با تمام اجزای واکنش PCR با چرخش با سرعت بالا به سطح روغن معدنی تزریق می‌شود و به این ترتیب قطرات کوچک آب معلق در روغن ایجاد می‌شود. هر قطره کوچک، فضای مستقل برای واکنش PCR را ایجاد می‌کند. در حالت ایده آل، هر قطره کوچک آب فقط حاوی یک بید و یک الگوی DNA است.

برروی سطح هر بید‌ در هر قطره ی آب، قطعات الیگونوکلئوتید ثابت شده است که این قطعات الیگونوکلئوتیدی با آداپتورهای متصل به نمونه، رابطه‌ی مکملی دارند. بنابراین DNA تک رشته‌ای نمونه می‌تواند به طور اختصاصی به بید متصل شود.

در واقع این سیستم انکوباسیون شامل تمامی واکنشگر‌های PCR است تا هر مولکول کوچک DNA که بر سطح بید ثابت شده است، بتواند یک نمونه برای تکثیر باشد.(هر قطره باید شامل یک نوع از نمونه باشد)

پس از تکمیل شدن واکنش، سیستم امولسیون از بین می‌رود و نمونه‌های هدف جمع آوری خواد شد. در انتها، هر قطعه کوچک حدود 1 میلیون بار تکثیر شده است تا به مقدار مورد نیاز فرآیند توالی یابی برسد.

1. Pyrosequencing

در مرحله بعد امولسیون را شکسته و محتویات درون آن را به داخل چاهک‌های  picotiterplateموجود در سطح یک پلیت منتقل می‌کنند.

روشی که جهت فرآیند توالی یابی استفاده می‌شود تکنیک پایرو سکوئنسینگ است. این تکنیک نیازمند DNA تک رشته بعنوان الگو می‌باشد که از طریق دناتوراسیون محصولات PCR بدست خواهد آمد. پس از اتصال پرایمر به توالی مکمل، سنتز رشته جدید به واسطه آنزیم پلیمراز آغاز می‌گردد و نوکلئوتید‌ها مرحله به مرحله جهت سنتز اضافه می‌شوند.

اگر dNTP اضافه شده با رشته ی الگو جفت شود، گروه پیروفسفات از واکنش رها می‌شود و پیروفسفات آزاد شده توسط آنزیم ATP سولفوریلاز مصرف شده  و  ATP تولید می‌شود. سپس آنزیم  لوسيفراز وارد عمل شده و با ATP تولید شده لوسفرین را به اکسی لوسفرین تبدیل کرده، که در نتیجه‌ی این واکنش نور تولید خواهد شد.

این سیگنال نوری توسط دوربین‌های حساس به سیگنال‌های ساطع شده موسوم به  CCD به صورت یک پیک ثبت می‌شود و از آنجایی که نوکلئوتیدهایی که در هر مرحله اضافه می‌شوند مشخص هستند، می‌توان توالی DNA را در حین سنتز بدست آورد.

سیستم توالی یابی 454Rochکاملاً با Solexa و Hiseq از Illumina متفاوت است. بزرگترین مزیت فناوری 454 Roch این است که طول خوانش توالی طولانی‌تر است. در حال حاضر، میانگین طول خوانش تا 400جفت باز است.

اما نقطه ضعف این روش است که قادر به توالی یابی دقیق قطعات هموپلیمر نیست. به علت این دلیل اجتناب ناپذیر، فناوری 454 Roch ممکن است نتایج حاوی خطاهای درج و حذف در توالی یابی ارائه دهد.

مترجم : مریم راحمی

مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی

آرشیو جدیدترین خبرهای روز دنیای بیولوژی