ریل تایم پی سی آر و آنالیز داده

Real-time PCR

تکنیک Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) امروزه به یکی از جدید ترین متد های حوزه ژنتیک مولکولی و پزشکی مبدل گشته است. مسئله مشخص هدف غایی هر سلول زنده ای تولید انواع پروتئین های مختلف جهت شکل دادن به خود و ادامه حیات می باشد. پروتئین های تولید شده می توانند در ساختار سلولی شرکت کرده و یا نقش های عملکردی مهم تری با عناوین هورمون ها، آنزیم ها، رسپتور ها و … داشته باشند. تمامی اتفاقاتی که درون یک سلول می افتد همه و همه به ژنوم آن سلول باز می گردد. ژنوم ساختاری محافظت شده با کاربرد ذخیره اطلاعات داشته و این اطلاعات را از نسلی به نسل های بعدی خود منتقل می کند. ژنوم با ساخت پروتئین ها و RNA های مختلف تمامی اعمال را تحت کنترل خود در آورده و یک سیستم بسیار پیچیده و حساس دارد که طی بیان های مختلف ژنومی و ساخت RNA های مختلف ساخت انواع پروتئین ها با مدیفیکاسیون های متنوع را هدایت می کند. پروتئین ها به تنهایی کارا نبوده و برخی اوقات مورد مدیفیکاسیون های مختلف قرار می گیرند و انواع گلیکوپروتئین ها، پروتئوگلیکان ها، لیپوپروتئین ها و … را می سازند که هر کدام نقش های مختلف دارند. همچنین سلول با دریافت مواد غذایی مختلف و کاتابولیسم آن ها مواد اولیه مورد نیاز جهت ساخت انواع بیومولکول ها توسط پروتئین های آنزیمی را فراهم می کند. همه ی این بیومولکول ها مارکر های ارزشمندی جهت مطالعه بوده و می توان در همه ی بیماری ها تغییرات مختلف آن ها را مورد بررسی قرار داد. اما نکته مهم اصلی به نام Central Dogma درون سلول های زنده می باشد که طبق این اصل سلول حساسیت خاصی نسبت به روند کنترل امور دارد. بدین معنا که بر اساس اصل Central Dogma سلول همیشه مسیر DNA به RNA و در صورت نیاز سپس مسیر RNA به پروتئین را طی می کند. این مسیر در تمامی موجودات زنده بغیر از برخی موارد خاص مانند ویروس ها حاکم بوده و همیشه در جریان می باشد و هیچ گاه خلاف آن اتفاق نمی افتد. لذا اگر عمیق تر این مسئله را مورد بررسی قرار داد، می توان گفت سر منشاء تمامی اختلافات سلولی و بیماری ها به ژنوم باز می گردد. البته محتوای ژنوم ثابت بوده و شرایط محیط یا به اصطلاح اپی ژنتیکی در رخ دادن اختلافات مختلف نقش دارند. مورد قابل توجه اینکه از تکوین و تمایز سلولی گرفته تا انواع بیماری های مختلف و حتی ورزش مداوم می توانند روی بیان ژن ها اثر مستقیم گذاشته و تولید برخی ترکیبات را کاهش و برخی را افزایش دهند. حتی یکی از دلایل دشواری مقابله به مثل با ویروس ها به دلیل حمله آن ها به هسته و DNA سلول می باشد و شرایط مقابله با آن ها را دشوار کرده است.

همانطور که ذکر شد محتوای ژنتیکی تقریبا همه سلول های یک موجود پرسلولی یکسان بوده و جهت بررسی تغییرات مختلف و مقایسه میزان بیان آن با سلول های دیگر همان موجود زنده، کاندید مناسبی نمی باشد. Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) یکی از تکنیک هایی می باشد که میزان بیان یک ژن را می سنجد. برای سنجش بیان بسته به ژن مورد نظر می توان از RNA تا پروتئین را مورد هدف قرار داده و میزان آن را سنجید. هرچقر میزان بیان یک ژن بالا باشد طبیعتاً میزان RNA تولید شده از آن بیشتر بوده و در صورت قابل ترجمه بودن RNA میزان پروتئین تولید شده از آن نیز افزایش خواهد یافت. سنجش فقط میزان پروتئین محدودیت هایی را بوجود می آورد که آن عدم توانایی سنجش برخی ژن ها که در نهایت به RNA رونویسی شده و سرنوشت ترجمه ندارند، می باشد. البته از طرفی اگر فقط RNA را مورد سنجش قرار گیرد نمی توان به تغییرات پس از ترجمه ای آن پروتئین دست یافت و دقیقاً دلیل بسیاری از بیماری ها در اثر اختلالات پس ترجمه ای می باشد. البته با نگاهی عمیقتر می توان بیان کرد تغییرات پس ترجمه ای خود با پروتئین های دیگری انجام می شوند که آن عامل مدیفای کننده خود ماهیت پروتئینی داشته و عدم عملکرد سر منشاء در تغییرات بیانی دارد. لذا اهمیت بررسی بیان ژنی در سلول ها بدین شکل می باشد.

در تکنیک Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) RNA مربوط به ژن هدف به عنوان کاندید مناسب بررسی بیان استخراج شده و با الگوی نوکلئوتیدی آن cDNA ساخته می شود. “برای آشنایی با cDNA کلیک کنید…

در ادامه عامل مورد سنجش مولکول های cDNA می باشند. در تکنیک Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر)  جهت استاندارد سازی بررسی بیان، میزان بیان ژن مورد نظر نسبت به یکسری ژن هایی تحت عنوان HouseKeeping Genes سنجیده می شود. ژن های HouseKeeping ژن هایی هستند که تحت هر شرایطی در سلول های مختلف یک موجود زنده بیان یکسانی داشته و در اثر بیماری های مختلف تغییر نمی کنند. عموما این ژن ها کد کننده پروتئین های آنزیمی مشارکت کننده در متابولیسم، پروتئین های کانالی در جذب مواد مغذی و … می باشند. به عنوان مثال ژن GAPDH کد کننده آنزیم «گلیسر آلدهید تری فسفات دهیدروژناز» می باشد که در چرخه گلیکولیز و کاتابولیسم گلوکز نقش داشته و همیشه در تمامی سلول ها میزان آن ثابت است. با بررسی میزان بیان و مقایسه آن نسبت به بیان ژن های HouseKeeping در هر نمونه، اطلاعات ارزشمندی به دست می آید که در نهایت آنالیز شده و می توان میزان بیان ژنی مشخص در چند نمونه مشخص را بدست آورد.

اهمیت بررسی بیان را می توان در تشخیص و درمان بیماری های مختلف مطرح کرد. به عنوان مثال در بیماری سرطان، سلول ها دچار انواع تغییرات بیانی، تغییر در مدیفیکاسیون های انواع پروتئین ها و … می شوند. با بررسی الگوی بیانی ژن های دخیل در سرطانی شدن یک رده سلولی مشکوک به سرطانی بودن و بررسی آن با بیان همان ژن ها در یک رده سلولی سالم از همان جنس و گونه، وجود یا عدم وجود بیماری را تشخیص داد. همچنین اگر یک دارویی را که ادعای ضد سرطانی بودن دارد، می توان با تیمار سلول های سرطانی در دز های مختلف دارویی و بررسی میزان تغییرات بیانی ژن های سرطانی، ادعا را با مستندات به واقعیت رساند.

دستگاه Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) یک سیستم اپتیکی داشته و بیان ژن ها را توسط خاصیت فلوئوفوری یک سری ترکیبات خاص چسبنده به DNA به دست می آورد. “برای آشنایی بیشتر با دستگاه Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) و نحوه عملکرد و سنجش بیان توسط آن کلیک کنید…

آزمایشگاه ژنیران در دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی و در بخش آموزش تکنیک Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) تمام تلاش بر آن داشته تا دانشجویان در طی دوره یکبار همراه با استاد و بار دیگر به تنهایی این تکنیک ارزشمند را انجام داده و آن را کامل یاد بگیرند. همچنین تمامی موادی که در اختیار دانشجویان قرار گرفته واقعی و Real بوده و این خود موجب می شود فرد با بررسی نتیجه نهایی خود به error های کار خود پی ببرد. همچنین آزمایشگاه ژنیران در این بخش از کارآموزی که مختص آموزش تکنیک Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) می باشد، علاوه بر ران کردن و اجرای این تکنیک، آنالیز داده های حاصل شده به شکل کامل آموزش داده می شود. چرا که داده های ارائه شده توسط دستگاه Real-time PCR (ریل تایم پی سی آر) به شکل خام بوده و آنالیز آن ها نیاز به مهارت افزایی و تسلط کامل بر این تکنیک دارد.