Blocking چیست؟

قبل از استفاده از آنتی بادی‌های خاص برای تشخیص آنتی ژن‌ها با استفاده از ایمونوهیستوشیمی (IHC) ( یا بافت‌شیمی ایمنی نام یک فرایند برای مکان‌یابی پروتئین‌ها در یاخته‌های یک بافت است.) ، باید تمام محلهای اتصال غیر اختصاصی احتمالی در نمونه بافت مسدود شود تا از اتصال آنتی بادی غیر اختصاصی جلوگیری شود.در صورت حذف یا ناکافی بودن انسداد، آنتی بادی‌ها یا سایر معرفهای تشخیصی ممکن است به مکانهای مختلفی متصل شوند که مربوط به واکنش پذیری آنتی بادی – آنتی ژنی خاصی نیستند. به عنوان مثال، آنتی بادی‌ها میتوانند با جذب ساده به انواع مختلفی از سطوح متصل شوند و به دلیل برهمکنش‌های مبتنی بر بار، آبگریز و سایر انواع، میتوانند به پروتئین‌ها متصل شوند.

معرفی

در اصل، هر پروتئینی که به طور خاص به آنتی ژن هدف یا آنتی بادی‌ها و سایر معرفهای تشخیصی در سنجش متصل نشود، میتواند برای مسدود کردن یا به اصطلاح blocking استفاده شود. با این حال، در عمل، برخی از پروتئین‌ها بهتر از بقیه عمل میکنند، زیرا به آسانی به مکانهای غیر اختصاصی (که به آنها محل واکنش نیز گفته میشود) در pH خنثی متصل میشوند یا عملکرد سایر اجزای سنجش را تثبیت میکنند. با این حال، هیچ پروتئین یا مخلوطی از پروتئین‌ها برای تمام آزمایش‌های IHC بهترین کار را نمیکند و آزمایش تجربی برای به دست آوردن بهترین نتایج ممکن برای ترکیب معینی از آنتی بادی‌های خاص و سایر معرفهای تشخیصی بسیار مهم است. در مثال زیر، بافر مسدود کننده Thermo Scientific Blocker BSA در آزمایش IHC فلورسنت برای تشخیص ویمتینین و پروتئین‌های B1 لامین استفاده شد.

این عکس مربوط به تشخیص فلورسنت IHC ویمتین و لامین B1 در بافت طبیعی روده بزرگ میباشد.

روشهای مسدود کردن عمومی

مرحله انسداد  (بافت شیمی)IHC اغلب پس از اتمام مراحل آماده سازی نمونه دیگر انجام میشود، اما درست قبل از انکوباسیون نمونه با آنتی بادی اولیه صورت میگیرد. پروتکل کلی این است که نمونه ثابت، جاسازی شده،  برش خورده، پارافین شده و بدون ماسک را با بافر (یک محلول شیمیایی است که از یک اسید ضعیف و نمک آن یا یک باز ضعیف و نمک آن ساخته می‌شود. محلول‌‌های بافر توانایی حفظ PH محلول را حتی در صورت افزودن اندکی باز یا اسید دارند.) مسدود کننده مناسب به مدت 30 دقیقه تا یک شب در دمای محیط یا 4 درجه سانتیگراد بر اساس پروتکل بهینه شده اختصاصی برای هر آنتی بادی و آنتی ژن هدف انکوبه کرد. شستشوی کافی پس از مرحله انسداد معمولاً به منظور حذف پروتئین اضافی انجام میشود که ممکن است مانع تشخیص آنتی ژن مورد نظر شود. با این حال، بسیاری از محققان پس از مرحله انسداد شستشو نمیدهند زیرا آنتی بادی‌های اولیه خود را در بافر مسدود کننده خود رقیق میکنند.

انواع بافرهای مسدود کننده(blocking buffer)

سرم معمولی (نرمال)

سرم نرمال 1-5 درصد ((w/v) یک جزء بافر مسدود کننده معمول است، زیرا سرم آنتی بادی‌هایی را حمل میکند که به محل‌های واکنشی متصل شده و از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی‌های ثانویه مورد استفاده در سنجش جلوگیری میکند. با این حال، یک عامل مهم استفاده از سرم از گونه‌های منبع برای آنتی بادی ثانویه است، در حالی که از گونه منبع برای آنتی بادی اولیه استفاده میشود. این به این دلیل است که سرم از گونه‌های آنتی بادی اولیه به محل‌های واکنش متصل میشود، اما آنتی بادی ثانویه آن آنتی بادی‌های محدود شده را به همراه آنتی بادی‌های خاص متصل به آنتی ژن هدف تشخیص میدهد. علاوه بر این، سرم غنی از آلبومین و سایر پروتئین‌ها است که به آسانی به محل‌های غیر اختصاصی اتصال دهنده پروتئین در نمونه متصل میشوند.

محلول های پروتئینی

علاوه بر سرم، بافرهای مسدود کننده اغلب حاوی پروتئین‌هایی مانند آلبومین سرم گاوی (BSA) ، ژلاتین یا شیر خشک بدون چربی هستند که در غلظت‌های نهایی 1-5درصد ((w/v) اضافه میشوند. این پروتئین‌های ارزان قیمت و به آسانی در دسترس یا به تنهایی یا با هم در مقایسه با غلظت آنتی بادی بیش از حد وجود دارند، بنابراین آنها برای اتصال به مکان‌های غیر اختصاصی نمونه با دومی رقابت میکنند. بسیاری از آزمایشگاه ها دستور بافر مسدود کننده خانگی مورد علاقه خود را دارند. با این حال ، مهم است که مطمئن شویم چنین بافرهای مسدود کننده عاری از رسوب و سایر آلاینده‌هایی هستند که میتوانند در تشخیص IHC (بافت شیمی) تداخل ایجاد کنند.

بافرهای تجاری از پیش تنظیم شده

بافرهای مسدود کننده آماده نیز برای انسداد نمونه‌ها در آماده سازی برای درمان آنتی بادی در دسترس هستند. این بافرها میتوانند حاوی پروتئین‌های تک تصفیه شده یا ترکیبات اختصاصی بدون پروتئین باشند. از مزایای استفاده از مسدود کننده‌های تجاری این است که گزینه‌های زیادی وجود دارد که عملکرد بهتری نسبت به ژلاتین، کازئین(پروتئین مخصوص شیر) یا سایر پروتئین‌هایی دارد که به تنهایی استفاده میشوند و عمر مفید آنها در مقایسه با آماده سازی‌های خانگی افزایش یافته است.

نکات مهم  مربوط به آزمایش مسدود کردن یا blocking

• هر دو پس زمینه (کنترل منفی) و قدرت سیگنال (کنترل مثبت) را با معرفهای مسدود کننده مختلف کنترل کنید.
• بافر مسدود کننده‌ای را انتخاب کنید که بالاترین نسبت سیگنال به نویز را ارائه میدهد.
• اطمینان حاصل کنید که هیچ ماده‌ای در بافر مسدود کننده وجود ندارد که با یک روش خاص تداخل داشته باشد. به عنوان مثال، شیر خشک بدون چربی حاوی بیوتین است و برای استفاده در هر سیستم تشخیصی که شامل پروتئین متصل کننده بیوتین باشد، نامناسب است.
• برای شرایط بهینه سنجش، از همان بافر مسدود کننده برای رقیق کردن آنتی بادی که برای مرحله انسداد استفاده میشود، استفاده کنید.

مترجم: غزل زارعی