دسته‌بندی نشده
نحوه دیفریز گرفتن از سلول های منجمد
نحوه دیفریز گرفتن از سلول های منجمد
دیفریز گرفتن صحیح از سلول ها، به منظور حفظ قابلیت زنده مانی و امکان بازیابی سریع تر کشت ، امری حیاتی و ضروری است. برخی از مواد کرایوپروتکتانت ، مانند DMSO ، در بالای 4 درجه سانتی گراد سمی هستند ، بنابراین ضروری است که ویال منجمد سلولی، قبل از دیفریز کامل در محیط کشت رقیق شوند تا اثرات سمی آن به حداقل برسد.
مواد مورد نیاز
- محیط کشت مناسب سلول
- PBS
- فالکون
روش انجام کار
- قبل از کار با رده ی سلولی مورد نظر، باید برگه اطلاعات سلول را به خوبی مطالعه کنید تا با نیاز های سلول به خوبی آشنا شوید.
- فلاسک ها را آماده کنید: برچسبی با نام رده سلول ، شماره پاساژ و تاریخ
- فریز سلولی را از محل ذخیره نیتروژن مایع خارج کنید.
- در یک فالکون 15 میلی لیتری، 6 الی 8 میکرولیتر PBS می ریزیم
- کرایوویال را در بن ماری 37 درجه قرار دهید تا ذوب شود. (یخ موجود در ویال نباید به طور کامل ذوب شود و باید تکه کوچکی یخ در ویال باقی بماند که نشان دهنده این است که دمای محتویات ویال هنوز 0 درجه است و اثر سمی کرایوپروتکتانت هنوز شروع نشده است.)
- سپس ویال حاوی یک تکه یخ را به طور کامل در فالکون حاوی PBS خالی کنید. (با این کار DMSO موجود در فریز سلولی رقیق می شود و اثر سمی آن خنثی می شود.)
- کل محتویات فالکون را در 5 دقیقه 1500 rpm سانتریفیوژ می کنیم و رسوب سلولی به دست می آید.
- پلت سلولی ایجاد شده رو نگه داشته و محیط رویی را دور می ریزیم.
- پلت سلولی را در 3 میلی لیتر محیط کشت مناسب سلول سوسپانس می کنیم.
- کل محتویات فالکون را به یک فلاسک جدید منتقل می کنیم تا سلول ها در آن کشت داده شوند.
- فلاسک را لیبل می کنیم و داخل انکوباتور CO2 قرار می دهیم.
- پس از 24 ساعت انکوباسیون، فلاسک را زیر میکروسکوپ بررسی کرده تا کیفیت و سلامت سلول ها بررسی شود.
نکات کلیدی
- برای اطمینان از کیفیت دیفریز می توان محیط کشت اولیه را کمی تغییر داد. به عنوان مثال:
- مقدار آنتی بیوتیک را کاهش داد. آنتی بیوتیک، میزان چسبندگی سلول ها به کف فلاسک را کاهش می دهد.
- مقدار FBS را می توان افزایش داد. FBS مواد مغذی محیط کشت را تامین می کند.
- پس از 24 ساعت انکوبه، محیط کشت را به حالت اصلی خود بر میگردانیم.
همچنین بخوانید…
خدمات کشت سلول آزمایشگاه ژنیران
