تکنیک ها
BLAST چیست؟
در بیوانفورماتیک، BLAST (ابزار جستجوی هم ترازی نواحی) یک الگوریتم و برنامه ای برای مقایسه اطلاعات اولیه توالی های بیولوژیکی نظیر توالی اسیدهای آمینه، پروتئین ها یا نوکلئوتیدهای DNA و یا RNA. BLAST کردن، این امکان را به پژوهشگر می دهد تا یک توالی پروتئین یا نوکلئوتیدی را که اصطلاحا query نامیده می شود، توسط یک کتابخانه ی توالی یابی یا یک بانک اطلاعاتی از توالی ها مقایسه کند و توالی های موجود در پایگاه داده را که مشابه توالی query است شناسایی کند.
بلاست کردن پرایمر
از ویژگی های مهم یک پرایمر خوب، اختصاصیت آن برای اتصال به ژن هدف است. در حالت ایده آل، یک جفت پرایمر تنها باید ژن هدف مورد نظر را تکثیر کنند و به قسمت های دیگر ژن به طور غیر اختصاصی متصل نشوند. این خاصیت پرایمر در تکنیک real time کمی (quantitative PCR) بسیار حائز اهمیت است چرا که در این تکنیک، مقدار محصول PCR به کمک شدت نور فلوئورسانس حاصل شده از DNA تکثیر شده برآورد می شود. به همین منظور، تکثیر محصول غیراختصاصی می تواند بر نتیجه ی تست اثر گذار باشد. از آنجا که قسمت های مختلف کروموزوم ها یا رونوشت آن ها به دلیل وجود مناطق همولوگ یا تطابقات تصادفی دارای شباهت نوکلئوتیدی هستند، جفت پرایمری که برای یک قسمت از DNA هدف طراحی شده است، ممکن است به صورت غیراختصاصی به نقاط دیگری از DNA متصل شوند.
برنامه Primer-BLAST از دو بخش تشکیل شده است – یک بخش طراحی جفت پرایمر و یک بخش بررسی میزان اختصاصیت پرایمر در اتصال به DNA هدف. Primer 3 نیز برنامه ای است که برای طراحی جفت پرایمرهای انتخابی، از روی یک توالی الگوی مشخص استفاده می شود. اختصاصیت پرایمر ها، توسط برنامه ی BLAST و به همراه الگوریتم هم ترازی جهانی (Needleman-Wunsch)، به منظور یافتن انطباق بین پرایمرها و الگوی هدف، بررسی می شود.
به منظور افزایش شانس در یافتن جفت پرایمر های اختصاصی، حداقل یکی از آن دو توالی پرایمر باید از مناطقی انتخاب شود که الگوی PCR در آن نواحی، شباهت زیادی به مناطق غیر اختصاصی نداشته باشد. برای دستیابی به این هدف، توالی الگوی PCR به MegaBLAST داده می شود تا نواحی غیر اختصاصی مشابه با توالی اصلی ما را از بین پایگاه های داده ی مشخص شده توسط کاربر شناسایی کند.
سپس به کمک نرم افزار Primer 3، در صورت امکان، حداقل یکی از جفت پرایمر را جوری انتخاب می کنیم که خارج از این مناطق (نواحی دارای مشابهت) قرار گیرد. اگر پایگاه داده ی انتخابی توسط کاربر، RefSeq یا NCBI-gi انتخاب شود، نرم افزار Primer-BLAST الگوی داده شده را از نظر تلاقی اگزون / اینترون و همچنین محل SNP (پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی) بررسی می کند و اطلاعات خود را از پایگاه داده ی NCBI Entrez می گیرد.
سپس جفت پرایمر های انتخابی، از نظر میزان اختصاصیت شان مورد بررسی قرار می گیرند. نرم افزار Primer 3 تعداد زیادی جفت پرایمر پیشنهادی را به کاربر ارائه می دهد و همه آنها نیاز به بررسی دارند تا میزان اختصاصیت آن ها و تمایلشان در اتصال مطلق به DNA الگو تعیین شود. اگر هر جفت پرایمر را بخواهیم با نرم افزار BLAST به طور جداگانه بررسی کنیم، این پروسه بسیار زمان بر خواهد بود . برای حل این مشکل، به این نتیجه رسیدند که هر پرایمر انتخابی باید زیر ناحیه ای از DNA الگو باشد (یعنی از همان توالی الگو گرفته شده باشد) و نتایج حاصل از نرم افزار BLAST که DNA الگو را مورد بررسی قرار داده است، باید حاوی تمام اطلاعات حاصل از تطابق همه ی پرایمر ها با توالی های موجود در پایگاه داده ی انتخابی باشد. در نتیجه، هنگامی که کاربر توالی DNA را به عنوان الگو به نرم افزار می دهد تا توالی های جدیدی از پرایمر را بگیرد، خود الگو منحصرا یک بار برای بررسی به نرم افزار BLAST داده می شود و این کار باعث کاهش چشم گیر کل زمان جست و جو در پایگاه های مختلف داده می شود.
همچنین بخوانید…
دوره کارآموزی بیوانفورماتیک آزمایشگاه ژنیران
