کلنی PCR

کلونینگ مولکولی نیازمند برخی از روش های غربالگری کلنی ها است تا اطمینان حاصل شود که قطعه مورد نظر درج شده است یا خیر. به طور معمول این کار به کمک هضم آنزیمی توسط آنزیم محدود کننده انجام می شود. اما کلنی PCR نیز می تواند همان کار را در زمان کمتری و با هزینه کمتر انجام دهد. مراحل کلیدی کلنی PCR عبارتند از: 1) طراحی پرایمرهای برای شناسایی قطعه درج شده 2) انجام یک واکنش PCR استاندارد (پرایمرها، dNTP ها، پلیمراز) با استفاده از سوسپانسیون باکتری های لیز شده به عنوان الگو 3) تجزیه و تحلیل اندازه محصولبه کمک ژل

طراحی پرایمرهای مناسب برای کلنی PCR

اولین و شاید مهمترین مرحله برای کلنی PCR، طراحی پرایمرها است. 3 راهکار برای طراحی پرایمر وجود دارد: 1) پرایمرهای اختصاصی برای قطعه درج شده 2) پرایمرهای خاص برای ستون فقرات ژن 3) پرایمرهای خاص جهت دار

1. پرایمرهای اختصاصی برای قطعه درج شده: پرایمرهای اختصاصی برای قطعه درج شده به منظور شناسایی توالی خاص درج طراحی می شوند. این یک آزمایش “بله یا خیر” است یعنی یک کلون مثبت حاوی قطعه مورد نظر، محصول را تولید و تقویت می کند و یک کلون منفی منجر به تولید هیچ محصولی نمی شود. این نوع پرایمرها فقط نشان می دهند که قطعه درج شده خاص شما وجود دارد یا خیر اما در خصوص اینکه در جهت صحیحی است یا حتی اگر در محل درستی واقع شده است، اطلاعاتی در اختیار ما قرار نمی دهد.
2. پرایمرهای مخصوص ستون فقرات: روش دوم، طراحی پرایمرهای خاص ستون فقرات است. این پرایمرها به منظور شناسایی و اتصال به محل هایی نزدیک به محل قرارگیری قطعه درج شده طراحی می شوند. یک کلون مثبت محصولی با اندازه ای بزرگتر از یک کلون منفی بدون ناحیه ی درج شده تولید می کند. این نوع جفت پرایمر همچنین برای غربالگری کلون هایی که با همان ستون فقرات ایجاد شده اند اما حاوی درج های مختلف هستند بسیار مناسب است.
3. پرایمرهای مخصوص جهت یابی: اگر به اطلاعاتی در مورد نحوه جهت گیری قطعه درج شده نیاز دارید، می توانید طراحی پرایمرهای مخصوص جهت یابی را انجام دهید. برای مثال، کلونینگ قطعه ای با انتهای بلانت یا صاف نمونه ای از مواردی است که ممکن است بخواهید از جهت درج آن مطلع شوید.

تنظیم واکنش PCR

تنظیم واکنش های کلنی PCR تقریباً مشابه واکنش PCR استاندارد است: الگو، پرایمرها، پلیمراز و dNTP ها را ترکیب کنید و سپس با یک برنامه استاندارد سیکل های دمایی PCR واکنش را آغاز کنید. یک تفاوت اساسی این است که DNA پلاسمید باید از باکتری آزاد شود تا به عنوان الگوی PCR عمل کند.

1. آماده سازی الگو: یک کلنی را با نوک پیپت انتخاب کرده و در مقدار کمی آب استریل سوسپانس کنید. در کل 3-10 کلنی را برای آزمایش انتخاب کنید، این مقدار بستگی به تعداد کلنی های موجود در پلیت کنترل دارد. هرچه تعداد کلنی های تشکیل شده بیشتر باشد، کلنی های بیشتری نیز برای غربالگری نیاز خواهید داشت.
2. ذخیره کلون برای کشت بعدی: در این مرحله باید از کلونی های خود به منظور استفاده های بعدی ذخیره تهیه کنید. به چند روش می توانید این کار را انجام دهید. اگر می خواهید در همان روز تجزیه و تحلیل کلنی PCR خود را انجام دهید، می توانید باقیمانده سوسپانسیون باکتری را ذخیره کرده و از آن ها برای کشت کلون های مثبت خود استفاده کنید. اگر می خواهید کلون های خود را طولانی مدت ذخیره کنید، فقط کلنی ها را روی پلیت LB کشت دهید. برای انجام کشت های مایع بعدی می توانید از این پلیت استفاده کنید. نهایتا می توانید با کلون هایی که انتخاب می کنید، کشت های مایع یک شبه را انجام دهید. صرف نظر از اینکه چه روشی را انتخاب می کنید، حتما از آنتی بیوتیک مناسب برای انتخاب استفاده کنید.
3. لیزر باکتری ها و تنظیم واکنش های PCR: سوسپانسیون باکتری باقی مانده به عنوان الگویی برای واکنش PCR شما عمل خواهد کرد. شما فقط باید لیزی از باکتری ها داشته باشید که DNA پلاسمید را آزاد کنید. در مرحله حرارت دهی اولیه واکنش PCR، باکتری لیز می شود. یک پلیمراز استاندارد Taq کافی است.
4. کنترل ها: بهترین کنترل ها برای کلنی PCR همان مواردی است که برای بررسی اینکه آیا پرایمرهای کلنی PCR درست عمل می کند یا خیر استفاده می شود.

تجزیه و تحلیل اندازه محصول PCR بر روی ژل

هنگامی که PCR تکمیل شد، زمان آن رسیده است که محصولات را روی ژل آگارز الکتروفورز کنید تا اندازه آن ها تعیین شود. قبل از پیپت کردن و لود کردن نمونه ها بر روی ژل، از رنگ لود کننده که حاوی گلیسرول نیز می باشد به نمونه های خود اضافه كنید و نهایتا از یک نشانگر Ladder برای مشخص کردن اندازه توالی ها استفاده کنید. شکل بالا نتایج پیش بینی شده کلی را برای سه نوع پرایمری که قبلاً شرح داده شدند نشان می دهد. هنگام استفاده از پرایمرهای اختصاصی قطعه درج شده (1)، کلون های مثبت (+) یک باند می دهند، در حالی که یک کلون منفی (-) باندی نمی دهد. پرایمرهای خاص ستون فقرات (2) در مقایسه با کلون های منفی، محصولات با اندازه بزرگتر را برای کلون های مثبت (+) ارائه می دهند. و نهایتا، پرایمرهای مخصوص جهت یابی (3) همان باند (+) یا بدون باند (-) را ارائه می دهد و همچنین جهت قرارگیری جهت قطعه درج شده را مشخص می کند.

تأیید توالی درج شده با تعیین توالیSanger

پس از شناسایی چند کلون مثبت، آخرین مرحله آماده سازی اولیه این کلون ها و ارسال پلاسمیدها برای تعیین توالی Sanger است. تعیین توالی این امکان را می دهد که  توالی درج شده، جهت قرار گیری آن را تأیید کنید. Colony PCR تعداد کلون هایی را که باید برای تعیین توالی ارسال کنید کاهش می دهد، اما مشخص نمی کند که آیا محصولات شما جهش دارد یا خیر.

همچنین از صفحات زیر دیدن فرمایید:
کارآموزی ژنتیک مهندسی ژنتیک و کلونینگ
خدمات و تجهیزات آزمایشگاهی مهندسی ژنتیک و کلونینگ 
مطالب علمی بیشتری را در ویکی ژن مطالعه فرمایید…