کشت خون محیطی در سیتوژنتیک: روش انجام و کاربردها

مقدمه ای بر کشت خون محیطی در سیتوژنتیک

بدن جانداران از سلول‌هاي متنوعي تشكيل شده است و اين تنوع باعث عملكرد اختصاصي‌تر اين سلول‌ها شده است. بنابراين تمام سلول‌ها مجبور به انجام تمام عملكردهاي فيزيولوژيـك يا توليد تمام انواع محصولات لازم براي بقاء فرد نيستند.

هر چند اغلب اين سلول‌هـا حـاوي ارگانل‌هاي داخلي مشتركي بوده و مسيرهاي متابوليك مشتركي را طي مي‌كنند، ولي هر سلولي اجزاء يا محصولات خاصي را بطور اختصاصي‌تر و به مقدار خيلي زيـادتر بيـان مـي‌كنـد. در حقيقت بيان اختصاصي اين جزء، موجب عملكرد اختصاصي سلول و متمايز شدن آن از سـاير‌سلول ها مي‌شود.

بطوريكه سلول‌هاي مختلف، توانايي‌هاي مختلفي در انقباض يا انتقال پالس‌هاي الكتريكي يا ترشح محصول خاصي نظير هورمون‌ها يا آنزيم‌ها و غيره دارند. اين تخصص در عملكرد سلول‌ها باعث مي‌شود كه حيوانات از انواع مختلفي از سلول‌ها تشكيل شوند.

اين سلول‌ها از نظر خصوصياتي نظير اندازه، شكل، سـاختمان و عملكـرد سـلولي بـا هـم متفـاوت هستند. به اين نوع تفاوت سلولي تمايز گفته مي‌شود. در حقيقت اين سلول‌ها از نظر ساختار ژنتيكي يكسان بوده ولي بيان ژن‌هاي آنهـا تفـاوت دارد، به طوري كـه مهـره‌داران داراي بـيش از 100 نوع سلول مختلف هستند كه در اعضاء مختلف با عملكردهاي مختلف ديده مـي‌شـوند.

بسياري از سلول‌هاي حيوانات را مي‌توان در خارج از بدن حيوان تكثير داد. سلول‌هاي جـدا شده از بافت‌ها و اعضاي حيوانات مي‌توانند در دماي مناسـب در يـك محـيط حـاوي مـواد غذايي و عوامل رشد درون ظروف پلاستيكي رشد كنند. بسياري از سلول‌هاي جانداران در محيط خارج از بدن قابل كشـت و نگهـداري هسـتند.

بـه عنوان مثال مي توان به سلول‌هاي بافت همبند نظير فيبروبلاستها؛ سلول هاي بافـت اسـكلتي نظير سلول‌هاي استخواني و غضروفي؛ سلول‌هاي بافت عضله قلب و عضله صاف؛ سلول هـاي اپي‌تليال نظير سلول‌هاي ريه، پستان، پوست، مثانه و كليه؛ سلول‌هاي عصبي نظير سلول‌هاي ميكروگليال؛ سلول هاي اندوكرين نظير سلول‌هاي غده آدرنـال، هيپـوفيز و جزايـر پـانكراس؛ ملانوسيتها و بسياري از سلول‌هاي سرطاني اشاره كرد.

در حقيقت توسعه تكنيك هاي كشـت سلولي عمدتاً مديون تحقيقات سرطان شناسي و ويروس شناسي مي‌باشد.

تاريخچه

کشت سلول به معنای رشد و تکثیر سلول‌های یک جاندار پرسلولی خارج از بدن میزبان می‌باشد که طی شرایط خاص آزمایشگاهی انجام می‌پذیرد.

هاريسون اولين كسي بود كه با ابداع تكنيك قطره معلـق توانسـت سـلول عصـبي قورباغـه را كشت دهد. او در سال 1907 قطعه‌اي از بافت عصبي جنين قورباغه را درون مايع لنف قـرار داد سپس اين لام را بطور وارونه بر روي يك لام گود قرار داد و اجازه داد تا مايع لنف منعقد گردد. او براي جلوگيري از خشك شدن قطره لنف اطراف لام را با موم پوشاند و بدين ترتيب توانست رشد سلول هاي عصبي جنين قورباغه را در قطره مذكور به مـدت چنـدين هفتـه بـا ميكروسكوپ نوري مورد بررسي قرار دهد. بعد از هاريسون Burrows و Carrel توانسـتند بـا كنترل شرايط استريل، سلول‌ها را براي چندين سـال بـدون آلـودگي كشـت دهنـد.

آنهـا بـا استفاده از مخلوطي از عصاره جنين جوجه و پلاسما شرايط مناسبي براي رشد و بقاء سلول هـا فراهم نمودند. در سال 1923 فلاسكهاي T شكل توسط Carrel معرفي شد.

ايـن فلاسـك هـا ظروف كوچكي با كف صاف بودند كه موجب حفظ شرايط استريل مي شدند. در سـال 1940 با شناخته شدن آنتي بيوتيك ها تحول شگرفي رخ داد. افزودن آنتـي بيوتيـك هـا بـه محـيط نگهداري سلول ها باعث كاهش عفونت‌هاي باكتريايي و در نتيجـه گسـترش و تثبيـت تكنيـك كشت سلولي گرديد.

در سال 1949 ويروس فلج اطفال توسط Enders در سلول هاي جنين انسان كشت داده شـد. كشف او اولين قدم در راه كاربردي شدن كشت سلول هـاي حيـواني و ورود ايـن تكنيـك از جنبه تحقيقاتي به جنبه هاي صنعتي بود. كشف او در حقيقت سرآغاز توليد واكسن فلج اطفـال و ريشه‌کن شدن يكي از معضلات پزشكي بود.

در سالهاي بعد با توليد محيط هاي كشت متعدد و تيره‌هاي سلولي مختلف امكان تحقيقات آزمايشگاهي روي داروها و انجام آزمـون هـاي سـم شناسي ممكن شد. در سال 1975، Kohler و Milstein با الحاق سلول‌هـاي ميلومـاي موشـي با لنفوسيت‌هاي B مولد آنتي‌بادي، سلول‌هاي هيبريدي توليد كردند كه قادر بـه ترشـح آنتـي‌بادي مونوكلونال بودند.

توليد آنتي‌بادي‌هـاي مونوكلونـال تحـول شـگرفي در تشـخيص‌هـاي آزمايشگاهي و درمان ايمونولوژيك سرطان‌ها فراهم آورد. در دهه 1970، با فراهم شـدن امكـان بيـان ژن‌هـاي مختلـف در باكتري‌هـا، تكنولـوژي توليـد پروتئين‌هاي نوتركيب بوجود آمد. امروزه آنتي‌ژن‌هاي ويروسي، هورمون‌ها، اينترفـرون گامـا و بسياري ديگر از پروتئين‌هاي ديگر به صورت نوتركيب در باكتري، مخمر يـا تيـره‌هـاي سـلولي پستانداران توليد شده و حتي بعضي از آن‌ها مصرف درماني پيدا كرده‌اند.

كاربردهاي كشت سلول

به كمك كشت سلولي مي توان سلول هاي همساني تهيه نمود و فعاليت‌هاي داخل سلولي از قبيل تكثير DNA، نسخه بـرداري از DNA و سـنتز RNA، سـنتز پـروتئين و سـاير جزئيات مربوط به متابوليسم را مطالعه كرد. همچنـين مـي‌تـوان پـس از اتصـال مولكول‌هـاي مختلف به گيرنده غشايي مربوطه، اتفاقات بعدي و جريانات داخل سـلولي از قبيـل جابجـايي اين كمپلكس‌ها، نوع پيام‌هاي داخل سلولي و نحوه انتقال پيام‌ها را بررسي نمود.

بـا اسـتفاده از سلول‌هاي كشت داده شده مي‌توان برهم كنش سلول‌ها بر روي يكـديگر را مطالعـه نمود. به علاوه مي‌توان محصولات توليد شده توسط سلول‌ها بخصوص سلول‌هاي سرطاني را مطالعـه نموده و از آنها براي راه اندازي آزمون هاي تشخيصي استفاده نمود. و بالاخره اينكه ژنوم ايـن سلول ها را مي توان دستكاري ژنتيكي نموده و يا آن‌ها را با اسـتفاده از ويـروس‌هـا يـا مـواد سرطان‌زا ناميرا نمود و بدين ترتيب تيره‌هاي سلولي جديد تهيه كرد..

محاسن كشت سلولي

كشت سلولي در مقايسه با استفاده از حيوانات آزمايشگاهي محاسن زيادي دارد. ايـن تكنيـك باعث توليد مقادير انبوهی سلول همسان و يك دسـت جهـت انجـام پـروژه‌هـاي تحقيقـاتي بيولوژي، پزشكي و غيره مي‌گردد.

انواع کشت براساس پارامترهای متفاوت

کشت‌های سلولی را می‌توان بر اساس پارامتر‌های زمان کشت، مورفولوژی، ویژگی‌های رشد و نوع بافت منشا تقسیم‌بندی کرد:

• زمان در کشت

کشت اولیه کِشتی از سلول ها، بافت‌ها یا اندام‌هایی است که مستقیماً از یک موجود زنده گرفته شده‌اند. زمانی که کشت اولیه تحت subculture قرار می‌گیرد، به آن کشت ثانویه می‌گویند. یک رده سلولی از یک کشت اولیه در زمان اولین subculture به وجود می‌آید. اصطلاح رده سلولی به این معنی است که کشت‌های حاصل از آن شامل دودمان‌های (lineage) متعددی از سلول هایی است که در اصل در کشت اولیه وجود داشته‌اند.

اگر این رده سلولی تنها از یک تک سلول حاصل شده باشد، از واژه کلون استفاده می‌شود و اگر ویژگی‌های خاص یا منحصر به فرد آن پس از subculture حفظ شود، به آن یک رده کلونی یا یک سویه گفته می‌شود. برای اهداف مختلف تحقیقاتی ، گزارش پارامترهای زمان کشت به صورت کمی می‌تواند مهم باشد.

تعداد دفعات subculture یا پاساژ، معرف تعداد دفعاتی است که سلول ها از یک ظرف به ظرف دیگر subculture (منتقل) شده‌اند، در حالی که بازه زمانی subculture نشان دهنده زمان بین subcultureهای متوالی است. زمان زایش سلولی (cell generation) بیانگر بازه زمانی تقسیم شدن متوالی یک سلول می‌باشد. زمان در کشت را می‌توان با «دو برابر شدن جمعیت» بیان کرد؛ یعنی بازه‌ی لازم برای دو برابر شدن تعداد سلول‌ها. تعداد دفعاتی که جمعیت سلولی دو برابر شده است دقیق‌ترین روشِ اندازه‌گیری طول عمر کشت است.

• ویژگی‌های رشد

کشت سلولی با نحوه رشد سلو‌ل‌ها نیز تعریف می‌شود. کشت تک لایه (کشت چسبان= adherent) به یک لایه سلولی اشاره دارد که روی یک سطح رشد می‌کند. کشت معلق (suspension) کشتی است که سلول‌ها به صورت شناور در محیط رشد و تکثیر می‌یابند. در نوع دیگری از کشت، سلول‌های تقسیم شونده بین تک لایه و سوسپانسیون قرار می‌گیرند و هرگز یک تک لایه واقعی ایجاد نمی‌کنند.

• مورفولوژی

با مشاهده سلول‌های کشت داده شده در میکروسکوپ معکوس (Invert) می‌توان کشت‌ها را بر اساس مورفولوژی تعریف کرد. بدون فراهم کردن شرایط خاص، سلول‌های کشت داده شده ساختار کامل بافت مبدا را حفظ نمی‌کنند. با این حال این سلول‌ها ظاهری دارند که در طول کشت باقی می‌ماند. کشت آمنیوسیت‌ها (یا AF-type) پلئومورفیک بوده و شامل ترکیبی از سلول‌های تک هسته‌ای و چند هسته‌ای می‌باشد (شکل 6- a، b).

• منشا بافت

کشت‌ها را می‌توان براساس منشا بافت نیز تقسیم‌بندی کرد؛ از جمله: سلول‌های معلق در مایع آمنیون، کشت‌های اولیه و ثانویه از پرز‌های جنینی، کشت‌های فیبروبلاستی از بیوپسی پوست، کشت سلول‌های خون‌ساز گرفته شده از مغز استخوان، کشت لنفوسیت‌های موجود در خون محیطی، تیموس یا گره‌های لنفاوی.

سلول های اپیتلیال (یا نوع E) سلول‌های چند ضلعی هستند. این سلول‌ها ورقه‌های پیوسته تک لایه با ماده بین سلولی کم تشکیل می‌دهند که در مقابل جداسازی با تریپسین مقاومت می‌کنند (شکل4- c). کشت های فیبروبلاست (یا نوع F) شامل سلول‌های دوکی تک لایه با چیدمانی تقریبا منظم می‌باشند (شکل 6- d).

اصطلاح فیبروبلاست به این معناست که این سلول‌ها یک ماتریکس خارج سلولی یا «فیبر» می‌سازند.