کروماتوگرافی کاغذی: تعریف، انواع، اصول کار، مراحل و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

کروماتوگرافی کاغذی چیست؟

کروماتوگرافی کاغذی (PC) نوعی کروماتوگرافی مسطح است که طی آن مراحل کروماتوگرافی روی نوعی کاغذ مخصوص انجام می‌شود.

PC به دلیل کاربرد آن در جداسازی، شناسایی و تعیین کمی ترکیبات آلی و معدنی، ساده‌ترین و پرکاربردترین روش کروماتوگرافی است.

اولین بار توسط دانشمند آلمانی کریستین فردریش شونبین(Christian Friedrich Schonbein) (1865) معرفی شد.

انواع کروماتوگرافی کاغذی

کروماتوگرافی جذبی کاغذی

“کاغذ آغشته به سیلیس یا آلومینا (آلومینیوم اکسید)” به عنوان جاذب (فاز ثابت) و حلال به عنوان فاز متحرک عمل می‌کند.

کروماتوگرافی پارتیشن کاغذی

رطوبت / آب موجود در منافذ الیاف سلولزی موجود در کاغذ صافی به عنوان فاز ثابت عمل می‌کند و فاز متحرک دیگری به عنوان حلال استفاده می‌شود. اغلب منظور از کروماتوگرافی کاغذی عمومی، همان کروماتوگرافی پارتیشن کاغذی است.

اصول کار کروماتوگرافی کاغذی

اصول کار کروماتوگرافی عمدتاً برمبنای جداسازی مواد طراحی شده است تا جذب. مواد بین فاز ثابت و فاز متحرک توزیع می‌شوند. لایه‌های سلولزی در کاغذ صافی حاوی رطوبت هستند و به عنوان فاز ثابت عمل می‌کند. حلال ها/بافرهای آلی به عنوان فاز متحرک استفاده می‌شوند. محلول در فاز ثابت حرکت می‌کند و نمونه را نیز با خود حمل می‌کند. اجزای نمونه بر اساس میزان جذبشان در فاز ثابت و میزان حل شدن در فاز متحرک، به راحتی از هم جدا می‌شوند.

اجزای کروماتوگرافی کاغذی

فاز ثابت و کاغذهایی که در آن استفاده میشود
فاز متحرک
محفظه برای قرارگیری نمونه
تشخیص و عوامل آشکارساز

فاز ثابت و کاغذهایی که در آن استفاده میشود

از کاغذهای صافی واتمن در گریدهای مختلف مانند شماره 1، شماره 2، شماره 3، شماره 4، شماره 20، شماره 40، شماره 42 و غیره استفاده می‌شود.
به طور کلی کاغذ حاوی 98-99٪ آلفا سلولز، 0.3 – 1٪ β-سلولز است.

سایر کاغذهای اصلاح شده

کاغذ صافی شسته شده با اسید یا باز
کاغذ از نوع فیبر شیشه‌ای.
کاغذهای هیدروفیل – کاغذهای اصلاح شده با متانول، فرمامید، گلیکول، گلیسرول و غیره.
کاغذهای هیدروفوب – استیلاسیون گروه‌های OH منجر به ماهیت آبگریزی می‌شود، از این رو می‌توان از آن برای کروماتوگرافی فاز معکوس استفاده کرد.
اشباع شده با سیلیس، آلومنا یا رزین‌های تبادل یونی نیز می‌توانند استفاده شوند.

کاغذ کروماتوگرافی فاز متحرک

میتوان از محلول بافر، حلال خالص یا مخلوطی از حلالها استفاده کرد.

مثال ها:

فاز متحرک هیدروفیل

ایزوپروپانول: آمونیاک:آب 9:1:2
متانول: آب 4:1
N-بوتانول: اسید استیک یخچالی: آب 4:1:5

فاز متحرک هیدروفوب

دی متیل اتر: سیکلوهگزان نفت سفید: 70% ایزوپروپانول
حلالهای رایج حلالهای قطبی هستند، اما به طورکلی انتخاب حلال به ماهیت ماده‌ای بستگی دارد که میخواهیم کروماتوگرافی کنیم.
اگر حلالهای خالص قادر به جداسازی مناسب نباشند، مخلوطی از حلالها استفاده میشود.

محفظه کروماتوگرافی

محفظه‌های کروماتوگرافی از مواد گوناگونی مانند شیشه، پلاستیک یا فولاد ضد زنگ ساخته شده اند. مخازن شیشه ای رایج‌تر هستند.
بسته به طول کاغذ و پیشروی نمونه، اندازه‌های ابعادی متفاوتی دارند.
محفظه باید از بخار حلال اشباع شود.

مراحل کروماتوگرافی کاغذی

در کروماتوگرافی کاغذی، نمونه روی یک تکه کاغذ صافی قرار میگیرد، لبه کاغذ در یک حلال شناور می‌شود و حلال بر اساس اثر مویینگی به سمت بالای کاغذ حرکت می‌کند. مراحل اساسی شامل:

انتخاب فاز ثابت

انتخاب کاغذ سلولزی با کیفیت خوب با تخلخل مشخص، وضوح بالا، انتشار اندک نمونه، و میزان حرکت مناسب حلال.

انتخاب فاز متحرک

بسته به آنالیت ممکن است از ترکیبات مختلفی از حلالهای آلی و معدنی استفاده شود.

مثال. بوتانول: اسید استیک: آب (12:3:5) حلال مناسبی برای جداسازی اسیدهای آمینه است.

اشباع مخزن

دیواره داخلی مخزن قبل از قرار دادن حلال در مخزن با کاغذ صافی پیچیده می‌شود تا وضوح بهتری حاصل شود.

آماده سازی و بارگذاری نمونه

در صورت جامد بودن نمونه، آن را در یک حلال مناسب حل می‌کنند. نمونه (2-20 ul) با استفاده از میکروپیپت به صورت نقطه‌ای روی خط مبنا بارگذاری و برای جلوگیری از انتشار کاملا خشک می‌شود.

پیشروی نمونه کروماتوگرافی شده

کاغذ صافی بارگذاری شده با نمونه را با دقت در ارتفاع بیش از 1 سانتی متر در حلال فرو میبریم و منتظر می‌مانیم تا لبه کاغذ به قسمت جلوی حلال برسد.

انواع مختلفی از تکنیکهای پیشروی را میتوان استفاده کرد:

صعودی

مانند نوع معمولی، حلال برخلاف گرانش جریان دارد.
لکه‌ها در قسمت پایین کاغذ در محفظه‌ای با حلال فاز متحرک در قسمت پایین نگهداری می‌شوند.

نزولی

این کار در یک محفظه مخصوص انجام می‌شود که محل نگهدارنده حلال در قسمت بالا قرار دارد.
لکه در قسمت بالا نگه داشته می‌شود و حلال به سمت پایین کاغذ جریان می یابد.
در این روش حلال از بالا به پایین حرکت می‌کند بنابراین کروماتوگرافی نزولی نامیده می‌شود.

صعودی – نزولی

ترکیبی از دو تکنیک فوق، کروماتوگرافی صعودی-نزولی نامیده می‌شود.
فقط طول جداسازی افزایش می‌یابد، ابتدا صعود و سپس نزول صورت میگیرد.

دایره ای / شعاعی

لکه در مرکز یک کاغذ دایره‌ای نگه داشته می‌شود.
حلال از طریق یک فیتیله در مرکز جریان می‌یابد و در همه جهات به طور یکنواخت پخش می‌شود.

خشک کردن کروماتوگرام

پس از پیشروی نمونه، جلوی حلال علامت گذاری می‌شود و درونdry cabinet یا فر (oven) قرار داده می‌شود.

تشخیص

آنالیت‌های بی رنگ با رنگ آمیزی با معرفهایی مانند بخار ید، نین هیدرین و غیره شناسایی میشوند.

آنالیتهای نشاندار شده و دارای فلورسنت به ترتیب با اندازه گیری رادیواکتیویته و فلورسانس شناسایی میشوند.

مقادیر Rf

برخی از ترکیبات در یک مخلوط، تقریباً به اندازه حلال حرکت می‌کنند. برخی به خط مبنا بسیار نزدیک تر می مانند. مسافت طی شده نسبت به حلال تا زمانی که سایر پارامترها مانند نوع کاغذ و ترکیب حلال ثابت باشند، برای یک ترکیب خاص ثابت است. مسافت طی شده نسبت به حلال را مقدار Rf می نامند.

بنابراین، برای به دست آوردن اندازه‌گیری از میزان حرکت یک جزء در آزمایش کروماتوگرافی کاغذی، “مقدار Rf” برای هر جزء جدا شده در کروماتوگرام محاسبه می‌شود. مقدار Rf عددی است که به عنوان مسافت طی شده توسط هر جزء از نمونه تعریف می‌شود.

کاربردهای کروماتوگرافی کاغذی

برای بررسی کنترل خلوص مواد دارویی،
برای تشخیصمواد تقلبی (اضافه شده به خوراکی و آشامیدنی)
شناسایی افزودنی‌های غیرمجاز در غذاها و نوشیدنی ها،
برای مطالعه تخمیر و رسیدگی مواد،
برای تشخیص مواد مخدر و مواد دوپینگ در حیوانات و انسان
در آنالیز لوازم آرایشی
آنالیز مخلوطهای درون واکنش در آزمایشگاه‌های بیوشیمیایی.

مزایای کروماتوگرافی کاغذی

ساده
سریع
کروماتوگرافی کاغذی به مواد بسیار کمتری نیاز دارد.
کروماتوگرافی کاغذی در مقایسه با سایر روشهای کروماتوگرافی ارزانتر است.
ترکیبات معدنی و آلی ناشناخته را میتوان با روش کروماتوگرافی کاغذی شناسایی کرد.
کروماتوگرافی کاغذی در مقایسه با سایر روشها یا تجهیزات تحلیلی، فضای زیادی را اشغال نمی‌کند.
قدرت تفکیک عالی