میدلبروک آگار (Middlebrook Agar): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده

مقدمه‌ای بر میدلبروک آگار

محیط‌های کشت زیادی برای کشت مایکوباکتری در طول سال‌ها ابداع شده است. محیط‌های کشت اولیه، فرمولاسیون‌های مبتنی بر تخم مرغ داشتند مانند محیط کشت لوونشتاین-جنسن (Lowenstein-Jensen) و محیط کشت پتراگنانی (Petragnani).

بعدها Dubos و Middlebrook فرمول‌های مختلفی حاوی اسید اولئیک (Oleic acid) و آلبومین (Albumin) به عنوان مواد اصلی، توسعه دادند که از مایکوباکتریوم در برابر عوامل سمی محافظت و به رشد باسیل‌های سل کمک می‌کند.

متعاقباً Middlebrook و Cohn فرمول اولئیک اسید-آلبومین آگار (Oleic acid-albumin agar) را بهبود بخشیدند و رشد سریعتر و انبوه گونه مایکوباکتریوم را فراهم ساختند.

محیط کشت پایه آگار میدلبروک 7H10 که توسط Middlebrook، Cohn و همکارانشان فرموله شد، با اصلاح اولئیک اسید-آلبومین آگار اصلی به دست آمد و سبب رشد سریع و انبوه گونه‌های مایکوباکتریوم شد.

پایه آگار میدلبروک 7H10 همچنین برای جداسازی، کشت و تست حساسیت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس بر پایه غنی‌سازی محیط با مکمل رشد OADC و گلیسرول، استفاده می‌شود. گزارشات نشان می‌دهند که در محیط کشت 7H10 نسبت به محیط‌های مبتنی بر تخم مرغ که معمولاً برای کشت مایکوباکتری‌ها استفاده می‌شود، آلاینده‌های کمتری رشد می‌کنند.

ترکیبات محیط کشت میدلبروک آگار

میدلبروک آگار 7H10 در هر 900 میلی‌لیتر

pH در دمای 25 درجه سانتی‌گراد: 0.2 ± 6.6

غنی ساز میدلبروک OADC

اصول میدلبروک آگار

میدلبروک آگار حاوی انواع نمک‌های غیرآلی است که مواد ضروری برای رشد مایکوباکتری را فراهم می‌کند. سیترات سدیم هنگامی که به اسید سیتریک تبدیل می‌شود، برای نگه‌داری کاتیون‌های غیرآلی خاص در محلول به کار می‌رود.

گلیسرول منبع فراوان کربن و انرژی است. در محیط غنی شده، کلرید سدیم، الکترولیت‌های ضروری را فراهم و تعادل اسمزی را حفظ می‌کند. اسید اولئیک و همچنین سایر اسیدهای چرب با زنجیره بلند، می‌توانند توسط باسیل‌های سل مورد استفاده قرار گرفته و نقش مهمی در متابولیسم مایکوباکتری‌ها ایفا کنند.

آلبومین موجود در محیط به محافظت از باسیل سل در برابر عوامل سمی کمک می‌کند، از این رو  میزان بازیابی آن‌ها در جداسازی اولیه را افزایش می‌دهد.

دکستروز، کربوهیدرات قابل تخمیر و منبع انرژی است در حالی که کاتالاز، پراکسیدهای سمی که ممکن است در محیط وجود داشته باشند را از بین می‌برد. مهار نسبی باکتری‌ها با حضور رنگ مالاشیت گرین حاصل می‌شود.

روش آماده‌سازی میدلبروک آگار

• 19 گرم از پودر میدلبروک آگار را در 900 میلی‌لیتر آب تصفیه شده حاوی 5 میلی‌لیتر گلیسرول بریزید.
• محیط را کاملا مخلوط کنید.
• با هم زدن مکرر حرارت داده و به مدت 1 دقیقه بجوشانید تا پودر کاملا حل شود.
• محیط را در دمای 121 درجه سانتی‌گراد به مدت 10 دقیقه اتوکلاو کنید.
• هنگامی که محیط تا دمای 50 تا 55 درجه سانتی‌گراد سرد شد، 100 میلی‌لیتر غنی‌ساز میدلبروک OADC را به طور آسپتیک (Aseptic) به محیط اضافه کنید.
• محیط را داخل لوله‌های استریل بریزید.

تفسیر نتایج در محیط کشت میدلبروک آگار

• کشت‌ها باید 5 تا 7 روز پس از تلقیح و پس از آن یک بار در هفته تا 8 هفته بررسی شوند.
• برای بررسی پلیت‌ها یا بطری‌ها، ظروف را روی صفحه میکروسکوپ تشریح برعکس کنید.
• با بزرگ‌نمایی 10 تا 60 برابر با نور عبوری بررسی را انجام دهید.
• برای بررسی وجود کلنی‌ها با بزرگ‌نمایی 10 تا 20 برابر به سرعت محیط را اسکن کنید.
• بزرگ‌نمایی بالاتر (30 تا 60 برابر) در مشاهده مورفولوژی کلنی مفید است. یعنی کلنی‌های طناب مانند مارپیچ.
• مشاهدات ذیل را ثبت کنید:
• تعداد روزهای مورد نیاز برای قابل مشاهده شدن کلنی‌ها از نظر ماکروسکوپی.
• تعداد کلنی‌ها (پلیت‌ها و بطری‌ها):
• بدون کلنی = منفی
• کمتر از 50 کلنی = تعداد واقعی
• 50 تا 100 کلنی = +1
• 100 تا 200 کلنی = +2
• تقریباً همریز (confluent) (200 تا 500 کلنی) = +3
• همریز (بیش از 500 کلنی) = +4
• تولید رنگدانه
• سفید، کرم یا براق = غیرکروموژنیک (Nonchromogenic (NC))
• لیمویی، زرد، نارنجی، قرمز = کروموژنیک (Chromogenic (Ch))

موارد استفاده از میدلبروک آگار

• آگار میدلبروک 7H10 هنگامی که غنی‌ساز میدلبروک OADC به آن اضافه می‌شود، در روش‌های کیفی برای جداسازی و کشت مایکوباکتریوم استفاده می‌شود.
• برای جداسازی، کشت و تست حساسیت مایکوباکتریوم توبرکلوزیس استفاده می‌شود.

محدودیت‌های محیط کشت میدلبروک آگار

• برای شناسایی کامل توصیه می‌شود آزمایشات بیوشیمیایی، ایمونولوژیک، مولکولی یا طیف‌سنجی جرمی روی کلنی‌های حاصل از کشت خالص انجام شود.
• از آنجایی که این محیط فقط تا حدی انتخابی است، اگر نمونه‌ها به‌طور مناسب آلودگی‌زدایی نشده باشند، باکتری‌های دیگری غیر از مایکوباکتری‌ها ممکن است در محیط رشد کنند.
• مایکوباکتریوم‌ها به شدت هوازی هستند و رشد آن‌ها با افزایش سطح CO2 تحریک می‌شود. درپوش‌های پیچ‌دار روی لوله‌ها یا بطری‌های آزمایش باید مطابق با دستورالعمل برای رد و بدل شدن CO2 به کار گرفته شوند.
• آگار میدلبروک 7H10 به منظور بازیابی مایکوباکتری‌ها نیاز به انکوباسیون در شرایط 5 تا 10 درصد CO2 دارد. مایکوباکتریوم‌ها به دلایل ناشناخته با کندل جار به خوبی بازیابی نمی‌شوند.
• محیط‌های تلقیح شده باید دور از نور یا حرارت بیش از حد نگه‌داری شوند، زیرا قرار گرفتن در معرض این دو عامل، باعث آزاد شدن فرمالدئید در محیط می‌شود که ممکن است مایکوباکتری‌ها را مهار یا از بین ببرد.
• نتایج کشت منفی، عفونت فعال توسط مایکوباکتری‌ها را رد نمی‌کند. برخی از عواملی که مسئول کشت‌های ناموفق هستند عبارتند از:
• نمونه نمایانگر مواد عفونی نباشد. یعنی استفاده از بزاق به جای خلط.
• مایکوباکتریوم‌ها در طی فرایند هضم و آلودگی‌زدایی نمونه از بین بروند.
• آلودگی شدید محیط در رشد مایکوباکتریوم‌ها دخالت کند.
• شرایط هوازی مناسب و افزایش سطح CO2 در طول انکوباسیون فراهم نشود.

جهت خرید و یا استعلام قیمت با ما تماس بگیرید یا در واتسپ پیام بزارید

02186073470

مطالب مرتبط با میدلبروک آگار:

• محیط کشت CVA (کمپیلوباکتر بلاد آگار): ترکیب، اصول، آماده‌سازی، نتایج و کاربرد
• هکتون انتریک آگار (محیط کشت HE): ترکیب، اصول، آماده‌سازی و نتایج4
• محیط کشت هارت اینفیوژن آگار (Heart Infusion Agar): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• محیط کشت انتخابی زغال چوب (Charcoal Selective Medium): ترکیب، اصول، روش آماده‌سازی، نتایج و موارد استفاده
• مایکوباکتریوم چیست؟

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا