ژنوتایپینگ چیست و چگونه کار می کند؟

ژنوتایپینگ چیست و چگونه کار می‌کند؟

ژنوتایپینگ به کشف رازهای ناشناخته در DNA ما کمک می‌کند. این روش در تحقیقات بالینی و تشخیص، و حتی در کشاورزی برای مقابله با چالش‌هایی مانند تغییرات آب و هوایی و گرسنگی کاربرد دارد. روش‌های مختلف ژنوتایپینگ به اندازه کاربردهایشان متنوع هستند، بنابراین در این مقاله، به ارائه یک نمای کلی از این زمینه وسیع، از جمله تعاریف، مهم‌ترین کاربردها و بررسی تکنیک‌های رایج خواهیم پرداخت.

ژنوتایپینگ چیست؟

ژنوتایپینگ یک اصطلاح کلی برای چندین روش مورد استفاده برای تجزیه و تحلیل تغییرات در ژنوم بین ارگانیسم‌های فردی است. این روش‌ها با مقایسه توالی DNA یک ارگانیسم با یک توالی مرجع یا نمونه دیگری، به دنبال تغییراتی مانند پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (SNPها)، درج‌ها و حذف‌ها می‌گردند.

SNPها

پلی‌مورفیسم‌های تک نوکلئوتیدی (مخفف SNP، تلفظ اسنیپ) تغییرات در یک موقعیت پایه منفرد در DNA را توصیف می‌کنند و رایج‌ترین نوع جهش ژنتیکی هستند. برای مثال، در ژنوم انسان، آنها به طور متوسط ​​هر 1000 نوکلئوتید وجود دارند، به این معنی که هر فرد دارای 4 تا 5 میلیون SNP در DNA خود است. روش‌های ژنوتایپینگ به شناسایی SNPها و تعیین اینکه چگونه بر عواملی مانند سلامتی، بیماری، پاسخ به دارو و سایر ویژگی‌ها تأثیر می‌گذارند، کمک می‌کنند.

درج‌ها و حذف‌ها

درج‌ها و حذف‌ها، که همچنین به «indels» معروف هستند، جهش‌هایی هستند که از اضافه شدن یا حذف یک یا چند نوکلئوتید در یک قطعه DNA ناشی می‌شوند. مانند SNPها، درج‌ها و حذف‌ها ممکن است هیچ اثر (شناخته شده‌ای) بر روی یک ارگانیسم نداشته باشند، اما می‌توانند اثرات منفی مانند ایجاد بیماری یا حتی مفید داشته باشند، برای مثال، یک ارگانیسم را در برابر عوامل بیماری‌زای خاص مقاوم کنند.

ژنوتایپینگ برای چه مواردی استفاده می‌شود؟

ژنوتایپینگ در تعدادی از بخش‌ها به کار می‌رود که مهم‌ترین آنها تحقیقات بالینی، تشخیص‌های بالینی و کشاورزی هستند. نمونه‌هایی از نحوه استفاده آن در این مناطق در زیر آمده است.

تحقیقات بالینی

اگر بتوان به طور آماری ثابت کرد که افرادی با یک تغییر ژنومی خاص به طور قابل توجهی بیشتر از سایر افراد در معرض ابتلا به بیماری خاصی هستند، این تغییر به طور بالقوه نشانگر افزایش خطر ابتلا به آن بیماری را فراهم می‌کند. هدف اصلی دیگر از انجام مطالعات ارتباط با بیماری، ایجاد داروهای شخصی‌سازی شده است.

تشخیص بالینی

در تشخیص، ژنوتایپینگ کاربردهای مختلفی دارد، از جمله:

• تست حساسیت ضد میکروبی: ژنوتایپینگ می‌تواند برای تعیین اینکه آیا یک سویه باکتریایی دارای ژن‌های مقاومت خاص یا جهش‌های ژنتیکی است که آن را نسبت به یک یا چند داروی آنتی‌بیوتیک غیر حساس می‌کند، استفاده شود.
• نظارت ژنومی: ژنوتایپینگ به ردیابی انواع ویروسی در طول پاندمی‌ها کمک می‌کند و به شناسایی زمان غالب شدن یک نوع جدید، مانند ویروس SARS-CoV-2، کمک می‌کند.
• تایپینگ HLA: تکنیک‌های ژنوتایپینگ برای یافتن اهداکنندگان و گیرندگان با الگوهای HLA (آنتی‌ژن لکوسیت انسانی) کاملاً مطابق استفاده می‌شود که به کاهش خطر رد پیوند کمک می‌کند.

کشاورزی

ژنوتایپینگ می‌تواند ژن‌های بالقوه‌ای را برای بهبود برنامه‌های اصلاح نژاد دام و زراعت شناسایی کند. این امر بسیار مهم است زیرا باید در نظر بگیریم که تولید مواد غذایی در دهه‌های آینده برای تغذیه جمعیت رو به رشد جهان در عین حال سازگاری و کاهش تغییرات آب و هوایی به طور چشمگیری نیاز به افزایش دارد.

نحوه عملکرد روش‌های مختلف ژنوتایپینگ

از آنجایی که ژنوتایپینگ یک حوزه گسترده است، نمی‌توانیم همه روش‌ها را در این مقاله توضیح دهیم. بنابراین بخش‌های زیر بر رایج‌ترین تکنیک‌ها برای شناسایی SNP‌های شناخته شده و یافتن موارد جدید تمرکز می‌کنند.

ژنوتایپینگ با PCR

دو روش رایج PCR برای تشخیص SNP ها، سیستم جهش دیرگداز تکمیلی PCR (ARMS PCR) و PCR بلادرنگ (qPCR) هستند.

ARMS PCR

برای ARMS PCR، که به آن PCR اختصاصی آلل نیز گفته می‌شود، باید چهار پرایمر مختلف به مخلوط اصلی خود اضافه کنید. اولین جفت پرایمر برای تکثیر توالی DNA حاوی SNP مورد نظر (قرمز) طراحی شده است.

دو پرایمر دیگر برای رشته مستقیم آلل نوع وحشی (Wt) (زرد) و رشته معکوس آلل جهش یافته (نارنجی) اختصاصی توالی هستند:

همانطور که در مثال بالا مشاهده می کنید، طی تکثیر سه محصول PCR قابل تولید است:

• یک توالی بلند که توسط جفت پرایمر اول (قرمز) تولید می شود.
• یک توالی کوتاه تولید شده توسط پرایمر مستقیم آلل نوع وحشی (Wt) و پرایمر معکوس جفت پرایمر اول (زرد)
• یک توالی کوتاه تولید شده توسط پرایمر معکوس آلل جهش یافته و پرایمر مستقیم جفت پرایمر اول (نارنجی)

برای اینکه ببینید چه محصولات PCR در نمونه شما وجود دارد، می توانید بعد از تکثیر، ژل آگاروز را اجرا کنید. اگر نمونه شما هموزیگوت باشد، فقط دو محصول PCR مشاهده خواهید کرد: توالی بلند به همراه یکی از توالی های کوتاه، بسته به اینکه ارگانیسم مورد تجزیه و تحلیل دارای دو نسخه از آلل Wt یا دو نسخه از آلل جهش یافته باشد. اگر نمونه شما هتروزایگوت باشد، هر سه محصول PCR تولید می شود.

برای اینکه بتوانید دو توالی کوتاه را از یکدیگر تشخیص دهید، SNP باید نزدیکتر به پرایمر مستقیم یا معکوس جفت پرایمر اول قرار گیرد. نمی تواند دقیقاً در وسط باشد زیرا در این صورت دو محصول کوتاه PCR طول مساوی خواهند داشت. همچنین باید هنگام انجام واکنش PCR نوع ARMS تعداد چرخه های حرارتی را کاهش دهید.

فقط 22 تا 25 چرخه برای کاهش خطر نتایج مثبت کاذب توصیه می شود. اگر تعداد چرخه های حرارتی افزایش یابد، پرایمرهایی که برای اتصال به آلل جهش یافته طراحی شده اند می توانند به طور غیر اختصاصی آلل های Wt را تکثیر کنند، به شرطی که غلظت آنها بسیار بالاتر باشد. دومین اقدام برای کاهش خطر نتایج مثبت کاذب، استفاده از استانداردهای داخلی است.

PCR نوع ARMS بیشتر در تنظیمات با کارایی پایین استفاده می شود، زیرا فقط می توانید یک SNP را در یک زمان در یک علیقت نمونه تشخیص دهید و چون اجرای ژل برای هر واکنش PCR زمان بر است.

با این حال، این روش برای تشخیص اختلالات خونی تالاسمی – که منجر به کاهش تولید هموگلوبین می شود – و کم خونی داسی شکل – که باعث ایجاد گلبول های قرمز با شکل غیرمعمول می شود، روش انتخابی است. مزیت آن نسبت به سایر روش ها – مانند ریزآرایه های DNA و توالی یابی نسل بعدی، که هر دو در زیر توضیح داده شده اند – این است که به هضم با آنزیم محدودکننده متکی نیست، به این معنی که دقیق تر است و می توان از آن در صورت نبود محل های محدودکننده در توالی DNA مورد نظر استفاده کرد.

qPCR

اگر می‌خواهید از qPCR برای تشخیص SNPها در یک نمونه استفاده کنید، با افزودن دو پروب با رنگ‌های گزارشگر مختلف به مخلوط اصلی، گردش کار استاندارد TaqMan qPCR را کمی تطبیق دهید. یک پروب باید برای اتصال به آلل Wt و دیگری برای اتصال به آلل جهش یافته SNP مورد نظر طراحی شود. پس از تکثیر، در صورتی که نمونه شما هموزیگوت باشد، عمدتاً یکی از سیگنال‌های فلورسنت را شناسایی خواهید کرد یا در صورتی که نمونه شما هتروزایگوت باشد، مقادیر مشابهی از هر دو سیگنال را مشاهده خواهید کرد. بنابراین، هنگامی که سیگنال‌های به‌دست‌آمده از چندین نمونه را در یک نمودار تفکیک آللی ترسیم می‌کنید، سه خوشه مشاهده خواهید کرد:

همانطور که در یک واکنش qPCR استاندارد، شما همچنین باید یک کنترل بدون قالب (آبی) را بگنجانید تا اطمینان حاصل کنید که آلودگی را زودهنگام شناسایی می‌کنید. آزمایش‌های qPCR را می‌توان در صفحات 96 یا 384 چاهک صرفه‌جویی در فضا راه‌اندازی کرد و این روش را به گزینه‌ای عالی برای گردش کار با تعداد زیادی نمونه تبدیل می‌کند. با این حال، از آنجایی که فقط می‌توانید یک SNP شناخته شده را در یک زمان در یک علیقت نمونه تشخیص دهید، برای تجزیه و تحلیل بیش از چند SNP مناسب نیست.

میکروآرایه‌های DNA

میکروآرایه DNA، که گاهی اوقات تراشه DNA نامیده می‌شود، مجموعه‌ای از نقاط میکروسکوپی DNA است که به یک سطح جامد متصل شده‌اند. هر نقطه حاوی هزاران نسخه از یک توالی DNA تک‌رشته‌ای خاص است که به عنوان پروب شناخته می‌شود. برای تشخیص SNPها با استفاده از آزمایش‌های میکروآرایه DNA، هر پروب باید به طور اختصاصی به آلل Wt یا جهش یافته یک SNP مورد نظر متصل شود.

برای تعیین SNPهای موجود در نمونه خود به شرح زیر عمل کنید:

• دناتوره کردن DNA، برش ssDNA به قطعات و برچسب زدن قطعات با استفاده از رنگ فلورسنت.
• وارد کردن نمونه به میکروآرایه و اجازه دادن به قطعات ssDNA برای هیبرید شدن به پروب‌ها.
• شستن قطعات DNA غیرمتصل شده، سپس اسکن و خواندن میکروآرایه. نقاط فلورسنت نشان‌دهنده SNPهای موجود در نمونه است.

همچنین می‌توانید دو نمونه را مخلوط کنید – به عنوان مثال، یک نمونه بیمار با برچسب قرمز و یک نمونه کنترل با برچسب سبز – و آن‌ها را به طور همزمان به میکروآرایه اضافه کنید. لکه‌های زرد نشان‌دهنده SNPهای مشترک هستند، در حالی که لکه‌های سبز و قرمز نشان‌دهنده SNPهایی هستند که به ترتیب فقط در نمونه‌های کنترل یا بیمار وجود دارند.

از آنجایی که هزاران پروب مختلف را می‌توان به یک میکروآرایه DNA واحد متصل کرد، این روش برای آزمایش‌هایی که نیاز به تشخیص تعداد زیادی SNP در یک نمونه است ایده‌آل است. با این حال، برای تنظیمات با کارایی بالا کمتر مناسب است، زیرا برای راه‌اندازی و تجزیه و تحلیل میکروآرایه‌ها برای صدها نمونه به فضای زیاد و زمان زیادی نیاز دارید.

مدارهای مجتمع سیالی

برای گردش کار با تعداد نمونه بالا یا آزمایش‌هایی که نیاز به افزودن، حذف یا جایگزینی پروب‌ها در صورت تقاضا دارند، مدارهای مجتمع سیالی (IFC) نسبت به میکروآرایه‌های DNA ترجیح داده می‌شوند. IFCها به جای استفاده از پروب‌هایی که روی یک سطح جامد ثابت یا پیش‌ spotted هستند، دارای ورودی‌های نمونه و آزمایش هستند:

موقعیت‌های پيپت‌گیری نمونه‌ها (نارنجی) و آزمایش‌ها (سبز) روی IFC آرایه دینامیکی 192.24 از Standard Biotools (قبلاً Fluidigm).

برای راه‌اندازی یک IFC، ابتدا نمونه‌های خود را در پلیت بارگیری کنید. سپس، یک مخلوط اصلی متفاوت به هر ورودی آزمایش اضافه کنید. همانطور که در ژنوتایپینگ با qPCR، هر مخلوط اصلی باید حاوی یک جفت پرایمر متصل به توالی DNA حاوی یک SNP مورد نظر، و همچنین پروب‌های اختصاصی برای هر دو آلل Wt و جهش یافته این SNP باشد.

هنگامی که IFC شما راه‌اندازی شد، نمونه‌ها و مخلوط‌های اصلی از طریق یک شبکه پیچیده از خطوط سیال، دریچه‌ها و غشاها عبور می‌کنند تا هر نمونه با هر مخلوط اصلی در یک محفظه واکنش میکروسیالی (مربع خاکستری در مرکز) ترکیب شود. با استفاده از یک IFC 192.24 (همانطور که در تصویر بالا نشان داده شده است)، این منجر به 4608 ترکیب مختلف می شود. سپس با استفاده از یک چرخه انداز qPCR ویژه، می توانید نمونه های خود را برای SNP ها همانطور که در بالا توضیح داده شد، تجزیه و تحلیل کنید.

اگر از IFC استفاده می‌کنید، ممکن است بخواهید مراحل بارگذاری را خودکار کنید، زیرا پيپت‌گیری دستی چنین فرمت پیچیده‌ای می‌تواند مستعد خطا و خسته‌کننده باشد. یک یادداشت کاربردی در مورد نحوه بارگیری IFC روی ربات پيپت‌گیری ASSIST PLUS را می توانید اینجا بیابید.

ژنوتایپینگ SNP MassARRAY

ژنوتایپینگ SNP MassARRAY از ترکیبی از PCR، اکستنشن تک نوکلئوتیدی و MALDI-TOF برای تشخیص SNP استفاده می کند و از مراحل زیر تشکیل شده است:

• انجام واکنش PCR برای تکثیر توالی DNA حاوی یک SNP مورد نظر.
• حذف نوکلئوتیدهای الحاق نشده با استفاده از فسفاتاز قلیایی میگو.
• افزودن پرایمرهای اکستنشن طراحی شده برای اتصال درست در کنار SNP، همراه با آنزیم‌های اکستنشن و ddNTP های خاتمه دهنده (dideoxynucleotides).
• در طول دومین واکنش PCR، پرایمرها با یک تک dideoxynucleotide، مطابق با نوکلئوتید SNP، گسترش خواهند یافت.
• از آنجایی که چهار ddNTP خاتمه دهنده – A، C، G و T – تفاوت های کمی در جرم مولی دارند، سپس می توانید این محصولات PCR را تجزیه و تحلیل کنید و با استفاده از MALDI-TOF SNP ها را شناسایی کنید.

ژنوتایپینگ با توالی‌یابی (GBS)

در روش‌های گفته شده قبلی، فقط می‌توان SNPهای شناخته شده را شناسایی کرد، زیرا برای این کار باید پرایمر و پروب‌هایی برای توالی DNA حاوی SNP مورد نظر طراحی کرد. در مقابل، ژنوتایپینگ با توالی‌یابی (GBS) که به آن ژنوتایپینگ نسل بعدی هم می‌گویند، برای شناسایی SNPهای جدید کاربرد دارد.

رایج‌ترین روش توالی‌یابی DNA در ژنوتایپینگ، توالی‌یابی نسل بعدی (NGS) است. در این روش، ابتدا با خرد کردن، خالص‌سازی و تکثیر نمونه DNA، کتابخانه‌ای تهیه می‌شود. سپس قطعات جداگانه با اتصال به سطوح جامد یا مهره‌های کوچک، به صورت فیزیکی ایزوله می‌شوند. توالی هر یک از این قطعات به طور همزمان تعیین می‌شود و از نظر محاسباتی با یک ژنوم مرجع “طبیعی” هم‌ترازی می‌شود. این کار امکان تشخیص بسیاری از تغییرات توالی، مانند SNPها، را در یک واکنش واحد فراهم می‌کند.

GBS تنها روشی است که می‌تواند SNPهای ناشناخته را شناسایی کند. از این روش می‌توان برای تعیین تعداد زیادی SNP در تعداد کمی نمونه استفاده کرد، زیرا میلیون‌ها توالی را می‌توان به طور موازی تجزیه و تحلیل کرد. با این حال، برای هر نمونه باید یک آزمایش جداگانه راه‌اندازی کرد.

نتیجه‌گیری

اگرچه روش‌های بالا به کشف و بررسی بی‌شماری از واریانت‌های ژنتیکی و تأثیر آنها کمک کرده‌اند، هنوز از درک عملکرد هر بخش از DNA فاصله زیادی داریم. ژنوتایپینگ به احتمال زیاد نقش مهمی در کشف این رازها ایفا خواهد کرد و در نهایت می‌تواند با پیشبرد پزشکی شخصی، تبدیل جهش‌های ژنتیکی به محصولات کشاورزی و دامداری سالم برای تغذیه نسل‌های آینده و موارد بسیار دیگر، به بهبود سلامت ما کمک کند.

همچنین بخوانید:

• PCR چیست؟ آموزش تکنیک PCR
• 37 مورد از انواع PCR به همراه تعریف، اصول و کاربرد
• تکنیک ARMS و Tetra-ARMS PCR
• تست حساسیت ضد میکروبی (AST): انواع و محدودیت‌ها
• ژنوتایپینگ خودکار چیست؟ اهمیت ژنوتایپینگ

منبع

مترحم: محمد صادق محمودی لرد