کنترل ها و انواع آن در فلوسایتومتری

برای عملکرد فلوسایتومتری، انواع مختلفی از کنترل ها وجود دارند که دقت و تکرارپذیری نتایج را تضمین می کنند.

کنترل عملکرد دستگاه

اولین نوع کنترل در فلوسایتومتری، کنترل دستگاه است که به عملکرد کلی و کالیبراسیون خود فلوسایتومتری مربوط می شود. کنترل‌های دستگاه برای اطمینان از عملکرد صحیح اجزای نوری، سیستم مایعات و الکترونیک دستگاه  ضروری هستند.

این شامل کالیبراسیون منظم لیزرها، فتودتکتورها و فیلترهای نوری برای حفظ حساسیت و وضوح مطلوب است. کنترل های دستگاه  همچنین شامل نظارت و تنظیم شدت جریان سیال و فشار غلاف برای اطمینان از تجزیه و تحلیل قابل اعتماد است.

کنترل FMO

کنترل فلورسانس منهای یک (FMO) یکی از کنترل های مهم با هدف تشخیص دقیق جمعیت مثبت و منفی سلول ها یا ذرات بر اساس شدت فلورسانس آنهاست.

کنترل های FMO نمونه های آزمایشی هستند که حاوی تمام فلوروکرومهای مورد استفاده در یک آزمایش است، به جز یک فلوروروکروم خاص که FMO برای آن تهیه شده است. این کنترل ها برای تعیین گیت مثبت و منفی ضروری است.

از آنجادیکه یک مرجع برای سطح فلورسانس پس زمینه ارائه می دهند و به محققان کمک می کنند تا مقادیر فلورسانس پایه را برای هر فلوروروکروم در پانل خود ایجاد کنند. محققان با مقایسه شدت فلورسانس سلولهای رنگ آمیزی شده با کنترل FMO با آنهایی که با پانل کامل فلوروکرومها رنگ آمیزی شده اند، می توانند به طور دقیق سطح اتصال غیر اختصاصی و اتوفلوئورسانس مرتبط با هر فلوروکروم را تعیین کنند.

این امر امکان شناسایی دقیق مقادیر مثبت کاذب را فراهم می کند و اطمینان می دهد که سیگنال فلورسانس مشاهده شده مختص جمعیت مورد هدف است.

در آزمایشات فلوسایتومتری، کنترل FMO به طور معمول در رابطه با کنترل ایزوتایپ و کنترل های مثبت برای اعتبار سنجی اختصاصیت و حساسیت رنگ آمیزی آنتی بادی و بهینه سازی جریان کار تجزیه و تحلیل داده ها استفاده می شود.

کنترل های FMO به محققان کمک می کند تا با اطمینان نتایج آزمایش های فلوسایتومتری خود را تفسیر کنند و منجر به تجزیه و تحلیل داده ها به صورت دقیق تر و قابل اعتماد تر می شود.

ایزوتایپ کنترل

در فلوسایتومتری، ایزوتایپ کنترل ابزار مهمی است که برای تمایز سیگنال واقعی از نویز پس زمینه غیر اختصاصی به منظور تفسیر دقیق نتایج استفاده می شود.

ایزوتایپ کنترل، آنتی بادی هایی هستند که آنتی ژن های موجود در سلولهای مورد مطالعه را هدف قرار نمی دهند و به عنوان یک پایه برای اندازه گیری نویز پس زمینه و اتصال غیر اختصاصی عمل می کنند. این کنترل ها به طور معمول آنتی بادی های همان ایزوتایپ مانند آنتی بادی های اولیه مورد استفاده در آزمایش هستند، اما آنها یک آنتی ژن نامربوط را هدف قرار می دهند.

محققان با رنگ آمیزی سلولهای با آنتی بادی اولیه و ایزوتایپ کنترل، می توانند هرگونه فلورسانس پس زمینه ناشی از اتصال غیر اختصاصی آنتی بادی اولیه را شناسایی و تفریق کنند. ایزوتایپ کنترل به ویژه در آزمایش های فلوسایتومتری چند رنگ که در آن چندین آنتی بادی به طور همزمان برای تشخیص چندین نشانگر در همان سلول استفاده می شود، از اهمیت ویژه ای برخوردار هستند.

محققان با در نظرگرفتن ایزوتایپ کنترل برای هر آنتی بادی مورد استفاده در پانل، می توانند اطمینان حاصل کنند که هر سیگنال مشاهده شده مخصوص آنتی ژن مورد علاقه است و به دلیل اتصال غیر اختصاصی نیست.

کنترل تکی همپوشانی (Single control compensation)

داده‌های فلوسیتومتری می‌توانند تحت تأثیر همپوشانی طیفی بین فلوروکروم‌ها قرار بگیرند که منجر به نتایج نادرست و تفسیرهای نادرست از جمعیت‌های سلولی می‌شود. جبران منفرد کنترل روشی است که برای تصحیح این همپوشانی طیفی و اطمینان از صحت و قابلیت اطمینان داده های فلوسیتومتری استفاده می شود.

در فلوسایتومتری، فلوروکروم ها مولکول هایی هستند که با برانگیختن طول موج خاصی از نور، نور فلورسنت ساطع می کنند. فلوروکروم‌های مختلف به آنتی‌بادی‌هایی که به نشانگرهای سلولی خاصی متصل می‌شوند، کونژوگه می‌شوند و به محققان اجازه می‌دهند تا جمعیت‌های مختلف سلولی را شناسایی و کمیت کنند.

با این حال، فلوروکروم‌ها می‌توانند طیف‌های گسیل گسترده‌ای داشته باشند که با یکدیگر همپوشانی دارند، که منجر به فلورسانس سرریز می‌شود که می‌تواند در تشخیص سیگنال‌های واقعی اختلال ایجاد کند. این همپوشانی طیفی می تواند منجر به نتایج مثبت کاذب یا منفی کاذب شود که بر تفسیر داده های تجربی تأثیر می گذارد.

کنترل تکی همپوشانی برای محاسبه همپوشانی طیفی در آزمایش‌های فلوسیتومتری استفاده می‌شود که شامل اندازه‌گیری سیگنال‌های فلورسانس نمونه‌های شاهد تک رنگ‌شده است، جایی که سلول‌ها تنها با یک آنتی‌بادی کونژوگه با فلوروکروم رنگ‌آمیزی می‌شوند.

با اندازه‌گیری شدت فلورسانس هر فلوروکروم به‌صورت مجزا، محققان می‌توانند ماتریس‌های جبرانی ایجاد کنند که میزان فلورسانس سرریز از هر فلوروکروم را به آشکارسازهای دیگر مشخص می‌کند. سپس این ماتریس‌های جبرانی به داده‌های فلورسانس جمع‌آوری‌شده از نمونه‌های رنگ‌آمیزی شده با چند فلوروکروم اعمال می‌شوند تا سهم سرریز را کم کرده و همپوشانی طیفی را تصحیح کنند.

فرآیند کنترل تک همپوشانی  با تهیه نمونه های شاهد تک رنگ آغاز می شود. سلول‌ها با آنتی‌بادی‌های کونژوگه با فلوروکروم منفرد انکوبه می‌شوند، برای حذف آنتی‌بادی‌های غیر متصل شسته می‌شوند و سپس بر روی فلوسایتومتری برای اندازه‌گیری سیگنال‌های فلورسانس هر فلوروکروم، آنالیز می‌شوند.

این اندازه‌گیری‌های فلورسانس برای محاسبه ضرایب سرریز برای هر فلوروکروم استفاده می‌شود، که نشان‌دهنده میزان فلورسانس منتشر شده توسط هر فلورکروم است که توسط آشکارسازهای فلوسایتومتری شناسایی می‌شود. سپس ضرایب سرریز در ماتریس‌های جبرانی گنجانده می‌شوند که در طول تجزیه و تحلیل داده‌ها به داده‌های فلورسانس نمونه‌های چند رنگ‌آمیزی اعمال می‌شوند.

همچنین بخوانید: