تکنیک ها

کلونینگ چیست؟

کلونینگ چیست؟
[aparat id=”ojvlu”]
کلونینگ

کلونینگ :کلونينگ فرآيندي است که طي آن توالي مشخصي از ژنوم را جداسازي مي‌کنند و با ادغام آن در یک DNA هدف، نسخه‌هاي يکساني از ژنوم را در محيط طبيعي ( سلول يا بافت زنده ) تکثیر می نمایند. هدف از ژن کلونينگ فراهم کردن نسخه‌هاي متعدد از يک ژن منفرد است که در حوزه‌هاي مختلف تحقيقاتي مورد استفاده است. به علاوه داراي کاربردهاي پزشکي از قبيل ژن درماني و کاربردهاي صنعتي و پزشکی نظير توليد مقدار زيادي از يک پروتئين مي‌باشد.

کلونینگ یک ژن شامل مراحل زیر است :

1 – جدا کردن قطعه ژنی مد نظر از بقیه ژنها

2 – انتخاب وکتور مناسب

3 – اینتگره کردن ژن با وکتور و تشکیل پلاسمید کامل ( DNA Recambinant )

4 – انتقال پلاسمید به سلول میزبان    ( Transformation)

5 – تکثیر (Replication ) و انتقال پلاسمید حاوی ژن از سلول مادر به سلولهای دختری

6 –رونویسی (Transcription  )

7 – ساخت پروتئین در فرایند ترجمه (Translation )

 

Cloning

کلونینگ بصورت کلی یعنی ایجاد کپی‌های یکسان از محصول مورد نظر. معمولا به معنای ایجاد یک کپی کاملا یکسان ژنتیکی از یک سلول، ارگانیسم، یا یک قطعه بیولوژیکی هم تعریف می‌شود. در بیولوژی ساخت مجدد یک ارگانیسم را reproductive cloning می‌گویند، همچنین به کپی کردن یک قطعه‌ی کوتاه از DNA ،  molecular cloningمی‌گویند.

 

MOLECULAR CLONING

در کلونینگ مولکولی با تکثیر یک قطعه DNA یا RNA تعداد زیادی از این قطعات به دست می آید که جهت بررسی یک ژن خاص یا بیان آن ژن از آنها استفاده می‌شود.

بنابراین به ایجاد یک قطعه یکسان از یک ژن یا DNA با استفاده از تکنولوژی مهندسی ژنتیک، Gene Cloning می‌گویند.

تمامی اسامی روبرو به تکنولوژی یکسانی اشاره میکنند.  “gene cloning,” “DNA cloning,” “molecular cloning,” and “recombinant DNA technology”.

زمانیکه DNA از یک ارگانیسم استخراج می‌شود، تمامی ژن‌های آن ارگانیسم خارج می‌شود. در gene (DNA) cloning یک قطعه خاص از ژن، کلونی‌های ما را تشکیل می‌دهد. در واقع کلونینگ یک روش برای جداسازی و تکثیر یک قطعه ژن خاص است.

DNA cloning از طریق دو روش به دست می آید:

Cell based DNA cloning     (1

 

Cell-free DNA cloning (PCR)     (2

 

Requirements for Gene Cloning (Cell-based)

1) قطعات DNA حاوی ژن موردنظر جهت کلونینگ

2) آنزیم‌های برش‌دهنده (Restriction enzymes) و آنزیم‌های متصل‌کننده (ligase enzymes)

3) وکتور (Vectors) جهت انتقال، نگهداری و تکثیر قطعه مورد نظر در سلول هدف

4) سلول هدف که توانایی تکثیر recombinant DNA را داشته باشد

 

کلونینگ

 

 

 

Principle of Gene Cloning

قطعه DNA مورد نظر که حاوی ژن هدف ما جهت کلونینگ است را به یک وکتور مناسب انتقال داده  تا recombinant DNA  را تشکیل بدهد. وکتور مانند یک وسیله نقلیه، ژن مورد نظر را به سلول میزبان منتقل می‌کند. وکتور معمولا یک باکتری است، اگرچه می‌تواند هر نوع سلول زنده‌ی دیگری باشد. در داخل سلول میزبان وکتور شروع به تکثیر میکند و علاوه بر DNA خود، تعداد بسیار زیادی از قطعه DNA مورد نظر ما را نیز که به داخل آن وارد شده را تکثیر میکند. زمانیکه سلول میزبان تقسیم می‌شود، recombinant DNA  های تکثیر  شده به سلولهای دختری منتقل شده و  تکثیر وکتور مجددا اتفاق می‌افتد. بعد از تقسیمات متعدد سلولی، کلونی‌ای از سلول‌های یکسان میزبان تشکیل خواهد شد. هر سلول داخل هر کلون حاوی یک یا تعداد بیشتری مولکول recombinant DNA است، حال می‌توان گفت که ژن درون مولکول recombinant کلون شده است.

 

 

Steps in Gene Cloning

 

7 مرحله‌ی اساسی و بیسیک در کلونینگ شامل موارد زیر می‌شود:

1) جداسازی قطعات DNA (ژن مورد نظر)، جهت کلونینگ

2) وارد کردن ژن مورد نظر به داخل یک وکتور مناسب جهت ایجاد recombinant DNA

3) وارد کردن recombinant DNA به داخل یک ارگانیسم مناسب که اصطلاحا میزبان (host) نامیده می‌شود.

4) انتخاب سلول‌های میزبان ترنسفورم شده و شناسایی کلون‌های حاوی ژن مورد نظر

5) تکثیر/بیان ژن هدف در سلول میزبان

6)  جداسازی کپی‌های ژنی تکثیر یافته/پروتئین‌های بیان شده از ژن هدف

7) خالص سازی و جداسازی قطعات ژنی/پروتئینی

کلونینگ

 

جداسازی قطعات DNA (ژن مورد نظر)، جهت کلونینگ

DNA یا ژن هدف جهت کلونینگ ابتدا باید جداسازی شود. ژن هدف قطعه‌ای از ژن است که کد کننده‌ی یک پروتئین، آنزیم یا هورمون است. بعنوان مثال ژن کد کننده‌ی انسولین.

جدا سازی ژن مورد نظر را می‌توان بوسیله‌ی اندونوکلئازهای محدودکننده (restriction endonuclease (RE) enzyme) انجام داد. این آنزیم‌ها DNA را در یک توالی خاص شناسایی و برش میدهند که اصطلاحا به این جایگاه برش، restriction sites می‌گویند، که براساس نوع برش میتوانند انتهای صاف یا چسبنده ایجاد کنند. گاهی اوقات ممکن است به آنزیم reverse transcriptase جهت سنتز ژن مورد نظر از روی نسخه‌ی mRNA  آن هم نیاز باشد.

 

انتخاب cloning vector مناسب

وکتور یک مولکول حامل است که دارای توانایی انتقال ژن مورد نظر (gene of interest (GI)) به میزبان، تکثیر در درون میزبان و تولید کپی‌های زیادی از ژن مورد نظر است. وکتورهای کلونینگ دارای محدودیت در سایز DNA انتقالی هستند. بنابراین براساس سایز قطعه مورد نظر و همچنین براساس هدف مطالعه، وکتور مناسب انتخاب می‌گردد. انواع وکتورهای کلونینگ متعددی در دسترس است مانند: پلازمید، باکتریوفاژ، کروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی  (BACs)، کروموزوم‌های مصنوعی مخمری (YACs) و کروموزوم‌های مصنوعی پستانداران  (MACs). از بین اینها پلازمیدها و باکتریوفاژها (phage λ) بیشترین وکتورهای مورد استفاده در کلونینگ هستند.

کلونینگ

کلونینگ

اجزای ضروری در کلونینگ وکتور

همه‌ی وکتورهای کلونینگ carrier DNA هستند، بنابراین این وکتورها باید دارای یکسری خصوصیت مشترک باشند ازجمله:

1) باید توانایی همانندسازی بصورت خودمختار در درون میزبان باشند

2) دارای جایگاه برش انحصاری برای آنزیم‌های محدودکننده (RE) باشد

3) قطعه DNA ی insert شده نباید در خصوصیات همانندسازی وکتور تداخل ایجاد کند

4) باید دارای تعدادی marker gene جهت آنالیزهای بعدی باشد تا بتوان از این ژنهای مارکر برای شناسایی سلول‌های  recombinantاستفاده کرد ( معمولا ژنهای مقاوم به آنتی بیوتیکی که در سلول میزبان وجود ندارد) .

5) باید به راحتی از سلول میزبان قابل جداسازی باشند

تشکیل Recombinant DNA

 

برش وکتور بوسیله‌ی همان آنزیم محدودکننده‌ای صورت می‌گیرد که ژن هدف بوسیله‌ی آن  برش خورده بود. سپس قطعات DNA ی مورد نظر را با وکتور برش خورده میکس میکنیم، پس از آن با اضافه کردن DNA ligase باعث اتصال ژن هدف به وکتور می‌شویم.

 نتیجه کار هیبرید دو قطعه DNA  می‌شود که شامل DNA هدف و وکتور است. در ژنتیک به اتصال دو مولکول DNA متفاوت، recombination گفته می‌شود. بنابراین مولکول DNA هیبریدی ایجاد شده را recombinant DNA molecule می‌نامند و به تکنولوژی ایجاد آن recom­binant DNA technology می‌گویند.

 

ترنسفورم کردن recombinant vector  به داخل میزبان مناسب

 Recombinant vector به داخل یک سلول میزبان مناسب ترنسفورم می‌شود که معمولا این سلول باکتری است. این کار به دو دلیل صورت می‌پذیرد: 1) تکثیر مولکول recombinant DNA به جهت تولید نخسه های زیادی از ژن هدف. 2) جهت بیان ژن هدف و ایجاد نسخه های زیادی از پروتئین  تولیدی آن ژن.

برخی از باکتری‌ها بصورت طبیعی قابلیت ترنسفورم کردن را دارند، بنابراین بصورت خودبخودی recombinant DNA را جذب میکنند مثل: Bacillus, Haemophillus, Helicobacter pylori . برخی دیگر از باکتری ها جهت ترنسفورم شدن به یکسری مداخلات خارجی نیاز دارند مانند: Ca++ ion treatment, electroporation و غیره.

کلونینگ

جداسازی سلولهای Recombinant 

پروسه ترنسفورماسیون باعث ایجاد مخلوطی از سول‌های میزبان ترنسفورم شده و ترنسفورم نشده می‌شود. پروسه فیلتر کردن این سلول‌ها به این صورت است که فقط سلول‌های ترنسفورم شده را جدا میکند، که برای اعمال این فیلتراسیون از marker gene های موجود در وکتور استفاده می‌شود. 

برای مثال وکتور پلاسمیدی PBR322 دارای marker gene های متعددی است (ژن‌های مقاوم به Ampicillin و ژن‌های مقاوم به Tetracycline). زمانیکه با استفاده از آنزیم محدود کننده‌ی pst1 ژن مقاوم به Ampicillin در این وکتورها از بین می‌رود، وکتورهای حاصل نسبت به آنتی بیوتیک Ampicillin حساس خواهند شد و در مجاورت این آنتی بیوتیک از بین خواهند رفت.

 

کلونینگ

تکثیر سلولهای میزبان انتخاب شده

بعد از اینکه سلول‌های میزبان ترنسفورم شده، از سلول‌های ترنسفورم نشده جدا شدند، باید شرایط اپتیمم را جهت تکثیر و افزایش این سلول‌ها فراهم کرد. بنابراین سلول‌های میزبان ترنسفورم شده به یک محیط کشت جدید و تازه، جهت کشت انتقال داده می‌شوند. در این مرحله همراه با تکثیر سلول‌های میزبان، DNA نوترکیب نیز تکثیر پیدا میکند.

 اگر هدف به دست آوردن تعداد زیادی نسخه از ژن هدف است، اجازه داده می‌شود تا سلول میزبان روند تکثیر عادی خود را در پیش بگیرد. اما اگرهدف به دست آوردن یک محصول خاص است، باید شرایط مطلوب جهت بیان ژن موردنظر، به منظور به دست اوردن پروتئین را فراهم نمود.

 

جداسازی و خالص سازی محصول

کلونینگ

در این مرحله نوبت به جداسازی ژن تکثیر یافته ی متصل به وکتور یا پروتئین حاصل از آن می‌رسد.

کاربردهای Gene Cloning

 

– به دست آوردن توالی یک ژن خاص

– آنالیز سکانس DNA

– بررسی عملکرد یک آنزیم ، RNA یا پروتئین

– بررسی جهش موجود در یک ژن

http://geniranlab.ir

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه

4.6 / 5. تعداد رای دهندگان: 63

تا حالا امتیازی برای این مطلب ثبت نشده؛ با ثبت نظرتون مارو خوشحال می‌کنید

Farbod Esfandi

Lab Director with a demonstrated history of working in the biotechnology industry. Skilled in Real-Time Polymerase Chain Reaction (qPCR), Cancer Research, Polymerase chain reaction (PCR), Karyotyping, and Data Analysis. Strong business development professional with a Master of Science - MS focused in Biotechnology from University of Glasgow.

15 دیدگاه در “کلونینگ چیست؟”

  1. کاربر ژنیران میگوید:

    باسلام چگونه ژنی که توالی آن را نمی‌دانیم تکثیر کنیم

    پاسخ
    • Farbod Esfandi میگوید:

      تکثیر یک ژن که توالی آن مشخص نیست، چالشی است، اما با استفاده از روش‌هایی مانند کلونینگ تصادفی، تکثیر از نمونه‌های مخلوط، یا تکنیک‌های مبتنی بر توالی‌یابی و بیوانفورماتیک می‌توان این مشکل را برطرف کرد. در اینجا چند روش برای این کار توضیح داده شده‌اند:

      1. کلونینگ تصادفی
      این روش شامل ایجاد کتابخانه‌ای از DNA کلی یک موجود (معمولاً با استفاده از آنزیم‌هایی مانند رستریکشن آنزیم‌ها یا ترانسپوزون‌ها برای شکستن DNA به قطعات کوچک‌تر) و کلون کردن این قطعات به بردارهای قابل تکثیر در میزبان میکروبی (مانند اشریشیا کلی) است. پس از این مرحله، می‌توان از روش‌های غربالگری برای شناسایی کلون‌های دارای عملکرد مورد نظر یا بیان پروتئین استفاده کرد.

      2. استفاده از نشانگرهای مخصوص
      اگر ژن مورد نظر با یک فعالیت آنزیمی یا ویژگی فیزیولوژیکی خاص همراه است، می‌توان از نشانگرهای مخصوص برای غربالگری کلون‌ها استفاده کرد. برای مثال، اگر ژن مورد نظر باعث مقاومت به یک آنتی‌بیوتیک خاص می‌شود، می‌توان کلون‌ها را در محیط حاوی آنتی‌بیوتیک کشت داد و کلون‌هایی که رشد می‌کنند را به عنوان حامل ژن مورد نظر شناسایی کرد.

      3. استفاده از روش‌های بیوانفورماتیک
      اگر داده‌های توالی‌یابی از گونه یا بافت مرتبط در دسترس باشد، می‌توان با استفاده از ابزارهای بیوانفورماتیکی توالی‌های کاندیدا برای ژن مورد نظر را شناسایی کرد. سپس از این توالی‌ها برای طراحی آغازگرها (پرایمرها) برای واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR) استفاده کرد و قطعه مورد نظر را تکثیر کرد.

      4. تکنیک‌های مبتنی بر توالی‌یابی RNA
      اگر ژن مورد نظر بیان می‌شود، می‌توان با استفاده از توالی‌یابی RNA (RNA-Seq) و تحلیل بیان ژن‌ها در شرایط مختلف، کاندیداهای بالقوه برای ژن مورد نظر را شناسایی کرد. سپس می‌توان با استفاده از پرایمرهای مبتنی بر توالی‌های RNA-Seq، ژن را از DNA کدگذاری‌کننده بازیابی کرد.

      این روش‌ها اجازه می‌دهند تا حتی بدون دانستن توالی دقیق یک ژن، بتوان آن را شناسایی و تکثیر کرد. این فرایندها به ویژه در تحقیقات پایه و کاربردی که به دنبال کشف ژن‌های جدید هستند، کاربرد دارند.

      پاسخ
  2. کاربر ژنیران میگوید:

    در پروسه کلونینگ روی پلیت جامد کلونی مشاهده میشود ولی بعد از کشت مایع و‌پروسه استخراج و‌انجام pcr نتیجه فاقد ژن مورد نظر میباشد
    اگر پیشنهادی برای رفع مشکل هست ممنون میشم راهنمایی کنید

    پاسخ
    • Farbod Esfandi میگوید:

      مشکلی که توصیف کردید می‌تواند به چند دلیل رخ دهد. در اینجا چند پیشنهاد برای رفع این مشکل و بهبود نتایج کلونینگ شما ارائه می‌دهم:

      1. بررسی کلونی‌ها بر روی پلیت جامد
      استفاده از کلونی‌های تک: مطمئن شوید که کلون‌هایی که انتخاب می‌کنید واقعا تک کلون هستند و از تلاقی چند کلون نشأت نگرفته‌اند.
      انتخاب بیشتر کلونی‌ها: گاهی اوقات لازم است تعداد بیشتری کلونی را بررسی کنید تا به کلون مطلوب برسید.
      2. بررسی مراحل کشت مایع
      کنترل دقیق شرایط کشت: اطمینان حاصل کنید که شرایط کشت مایع برای بقاء پلاسمید مناسب است، مانند دما و زمان کشت.
      استفاده از آنتی بیوتیک مناسب: مطمئن شوید که آنتی‌بیوتیک مورد استفاده برای حفظ پلاسمید در باکتری‌ها مناسب است.
      3. بررسی فرآیند استخراج DNA
      کیفیت DNA: اطمینان حاصل کنید که DNA استخراج شده تمیز و بدون آلودگی است. آلودگی‌ها می‌توانند تأثیر منفی بر PCR داشته باشند.
      کنترل کمیت و کیفیت DNA: استفاده از اسپکتروفتومتر یا نانودراپ برای اندازه‌گیری غلظت DNA و بررسی نسبت های OD260/280 و OD260/230.
      4. بررسی پروسه PCR
      طراحی پرایمرها: مطمئن شوید که پرایمرهای مورد استفاده برای تشخیص ژن مورد نظر مناسب هستند.
      شرایط PCR: بهینه‌سازی شرایط PCR، مانند دمای آنیلینگ و زمان تمدید، می‌تواند تفاوت زیادی در نتایج ایجاد کند.
      5. کنترل‌های مثبت و منفی
      استفاده از کنترل‌ها: همیشه در آزمایشات PCR خود از کنترل‌های مثبت و منفی استفاده کنید تا از صحت واکنش‌های خود مطمئن شوید.
      6. بررسی مجدد کلونینگ
      توالی‌یابی: اگر مشکلات برطرف نشد، توصیه می‌کنم کلون‌های نهایی را توالی‌یابی کنید تا از درستی ورود ژن مورد نظر به پلاسمید مطمئن شوید.
      امیدوارم این پیشنهادات به شما کمک کنند تا مشکل موجود در فرآیند کلونینگ خود را حل کنید.

      پاسخ
  3. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام
    آیا در ایران کلونینگ حیوان خانگی از دست رفته انجام میشود؟

    پاسخ
  4. کاربر ژنیران میگوید:

    سلام وقتتون بخير باشه،ميبخشين من يزد زندگي ميكنم و كار هم ميكنم(شنبه تا ٤شنبه)،به استثناي اين يك ماه تابستون كه تعطيلات هست و فقط شنبه يكشنبه دوشنبه بايد كار كنم.ميخواستم بدونم شرايطي وجود داره براي حضور من در كلاس مهندسي ژنتيك (كلونينگ ژن). مثلا حضور انلاين!اخر هفته ها!و هر چيز ديگه اي؟!يا فعلا براي شهرهاي ديگه اين امكان وجود نداره؟!

    پاسخ
    • فائزه فلاحی میگوید:

      با سلام ، دوست عزیز کلاس های مهندسی ژنتیک و کلونینگ حضوری و آنلاین است، میتونید دوره های فشرده آخر هفته ها رو شرکت کنید.

      پاسخ
  6. کاربر ژنیران میگوید:

    تفاوت روش کلونینگ مکانی وکلونینگ بر اساس عملکرد چیست؟

    پاسخ
    • Farbod Esfandi میگوید:

      رویکرد: کلونینگ مکانی بر مبنای شناسایی ژن‌ها بر اساس موقعیت فیزیکی آنها در ژنوم است، در حالی که کلونینگ بر اساس عملکرد بر شناسایی ژن‌ها بر اساس عملکرد پروتئین‌هایی که تولید می‌کنند، متمرکز است.

      اطلاعات مورد نیاز: کلونینگ مکانی می‌تواند بدون دانش قبلی در مورد عملکرد ژن انجام شود، در حالی که کلونینگ بر اساس عملکرد نیاز به دانش اولیه یا فرضیه‌ای در مورد عملکرد ژن دارد.

      کاربردها: کلونینگ مکانی اغلب برای پیدا کردن ژن‌های مرتبط با بیماری‌ها استفاده می‌شود، در حالی که کلونینگ بر اساس عملکرد برای تحقیق در مورد مسیرهای بیوشیمیایی و وظایف متابولیکی به کار می‌رود.

      با پیشرفت‌های اخیر در تکنولوژی‌های ویرایش ژنتیک و توالی‌یابی ژنوم، هر دو روش کلونینگ فرصت‌های جدیدی را برای تحقیقات بیومدیکال و کاربردهای بالینی فراهم کرده‌اند.

      پاسخ
  7. شاه ولیان میگوید:

    مرسی بابت مطالب خوبتون.اساتید هم خیلی خوب مطالب رو در دوره ها توضیح دادند

    پاسخ
  8. E_G میگوید:

    سلام چرا در فرآیند اتصال دو قطعه DNA یا Ligation از آلبومین سرم گاوی(BSA) استفاده میکنن؟

    پاسخ

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *