کشت ویروس: تکنیک ها، اصول و اهداف

مقدمه‌ای بر کشت ویروس

ویروس­‌ها انگل‌­های داخل سلولی هستند و برای بقای خود به میزبان وابسته هستند. آن­ها را نمی‌توان در محیط­‌های کشت غیر زنده یا در ظروف آگار به تنهایی پرورش داد، ویروس‌­ها به سلول‌های زنده برای پشتیبانی از تکثیر خود نیاز دارند.

اهدف اصلی کشت ویروس عبارت است از:

• جداسازی و شناسایی ویروس­‌ها در نمونه­‌های بالینی.
• تحقیق در مورد ساختار ویروسی، تکثیر، ژنتیک و اثرات آن روی سلول میزبان.
• آماده‌­سازی ویروس‌­ها برای تولید واکسن

کشت ویروس‌­ها را تحت عناوین زیر می‌­توان مورد بحث قرار داد:

• تلقیح حیوانات
• تلقیح به تخم جنین شده
• کشت سلولی

تلقیح حیوانات

• ویروس‌هایی را که نمی‌­توان در تخم­‌های جنین شده و یا به وسیله کشت بافت رشد داد، می‌­توان در حیوانات آزمایشگاهی مانند موش، خوکچه هندی، همستر، خرگوش و پستانداران کشت نمود.
• حیوانات انتخاب شده باید سالم و عاری از هرگونه بیماری واگیردار باشند.
• موش­‌های شیرخوار (کمتر از 48 ساعت سن) بیشتر مورد استفاده قرار می­گیرند.
• موش­‌های شیرخوار به ویروس­‌های توگاویروس (Togavirus) و کوکساکی (Coxsackie) حساس هستند که از راه‌­های داخل مغزی و داخل بینی تلقیح می­شوند.
• ویروس‌­ها را می­توان از طریق داخل صفاقی و زیر جلدی نیز تلقیح کرد.
• پس از تلقیح، ویروس در میزبان تکثیر شده و بیماری ایجاد می­کند. حیوانات جهت بررسی علائم بیماری و مرگ زیر نظر گرفته می­شوند.
• سپس ویروس از بافت این حیوانات جدا و پالایش می­شود.
• برای اولین بار تلقیح زنده بر روی داوطلبان انسانی برای مطالعه ویروس تب زرد استفاده شد.

مزایای کشت ویروس به روش تلقیح حیوانات

1. تشخیص، بیماری‌­زایی و علائم بالینی ویروس مشخص می­شود.
2. تولید آنتی بادی قابل شناسایی است.
3. در جداسازی اولیه ویروس­‌های خاص کمک می­کند.
4. موش‌­ها مدل قابل اعتمادی برای مطالعه تکثیر ویروس ارائه می­دهند.
5. برای مطالعه پاسخ‌­های سیستم ایمنی، اپیدمیولوژی (Epidemiology) و انکوژن (Oncogenesis) استفاده می­شود.

معایب کشت ویروس به روش تلقیح حیوانات

1. گرانی و مشکلات نگه­داری از حیوانات.
2. مشکل در انتخاب حیوانات مناسب برای یک ویروس خاص
3. برخی از ویروس‌­های انسانی نمی­توانند در حیوانات رشد کنند، یا می­‌توانند رشد کنند اما باعث بیماری نمی­شوند.
4. موش­‌ها مدل‌­هایی برای تولید واکسن ارائه نمی­‌دهند.
5. تلقیح حیوانات منجر به ایجاد نسلی از ویروس‌های جهش­ یافته می­شود.
6. مسائل مربوط به سیستم­‌های رفاه حیوانات.

تلقیح به تخم جنین شده

• Goodpasture در سال 1931 برای اولین بار از تخم مرغ جنین شده برای کشت ویروس استفاده کرد.
• فرایند کشت ویروس­‌ها در تخم‌­های جنینی بستگی به نوع تخمی دارد که استفاده می­شود.
• ویروس­‌ها به جنین جوجه 12-7 روزه تلقیح می­شوند.
• باید تخم‌ها را برای تلقیح جهت کشت آماده کرد. ابتدا سطح پوسته را با ید ضد عفونی می‌کنند و با یک مته کوچک استریل آن را سوراخ می‌کنند.
• پس از تلقیح، سوراخ تخم با ژلاتین یا پارافین بسته شده و در دمای 36 درجه سانتیگراد به مدت 2-3 روز انکوبه می­شود.
• پس از انکوباسیون، تخم شکسته شده و ویروس از بافت تخم جدا می­شود.
• رشد و تکثیر ویروس در جنین تخمک با مرگ جنین، آسیب سلولی جنین، یا با تشکیل جوش‌­ها یا جراحت­‌های معمولی روی غشای تخم مشخص می­شود.
• ویروس­‌ها را می­‌توان در قسمت‌­های مختلف تخم مانند غشای کوریوآلانتوئیک (Chorioallantoic membrane (CAM))، حفره آلانتوئیس (Allantoic cavity)، کیسه آمنیوتیک (Amniotic sac) و کیسه زرده (yolk sac) کشت کرد.

1. غشای کوریوآلانتوئیک:

• تلقیح در این قسمت، عمدتاً برای رشد ویروس آبله است.
• پس از انکوباسیون، جراحات قابل مشاهده‌­ای به نام پوک (Pock) دیده می­شود که نقاط سفید و خاکستری در قسمت شفاف CAM هستند.
• ویروس هرپس سیمپلکس (Herpes simplex) نیز در CAM رشد می­کند.
• یک ویروس باعث ایجاد یک پوک می­شود.
• تلقیح در CAM برای مطالعه بر روی پلاک‌­ها (Plaque) نیز مناسب است.

2. حفره آلانتوئیس:

• تلقیح در این قسمت عمدتاً برای تولید واکسن ویروس آنفلوانزا، تب زرد و هاری انجام می‌شود.
• اکثر ویروس­‌های پرندگان را می­توان با استفاده از تلقیح در این قسمت کشت کرد.

3. کیسه آمنیوتیک:

• تلقیح در این قسمت عمدتاً برای جداسازی اولیه ویروس آنفولانزا و ویروس اوریون انجام می­شود.
• در این روش، رشد و تکثیر ویروس در جنین تخم با آزمایش هماگلوتیناسیون (haemagglutination) قابل تشخیص است.

4. تلقیح کیسه زرده:

• تلقیح در این قسمت ساده­‌ترین روش برای رشد و تکثیر ویروس است.
• برای کشت برخی ویروس­‌ها و برخی باکتری‌ها (کلامیدیا (Chlamydia) و ریکتزیا(Rickettsiae)) تلقیح در این قسمت انجام می­شود.
• مکانیسم­‌های درگیری سیستم ایمنی در کشت اکثر ویروس‌­های پرندگان با تلقیح در این قسمت قابل تشخیص است.

مزایای تلقیح در تخم جنین شده

• روشی پرکاربرد برای رشد و جداسازی ویروس می­باشد.
• بستری ایده‌­آل برای رشد و تکثیر ویروس است.
• قابلیت جداسازی و کشت بسیاری از ویروس‌های پرندگان و تعداد کمی از پستانداران در این روش وجود دارد.
• مقرون به صرفه بوده و نگه­داری آن بسیار آسان­‌تر است.
• نیروی کار کمتری نیاز است.
• تخم­‌های جنین شده به راحتی در دسترس هستند.
• استریل بوده و طیف وسیعی از بافت‌­ها و مایعات وجود دارد.
• تخم جنین شده عاری از باکتری­‌های آلوده کننده و بسیاری از ویروس‌­های پنهان می­باشد.
• عوامل دفاعی اختصاصی و غیر اختصاصی در تخم‌های جنینی دخیل نیستند.
• تلقیح در تخم جنین شده به طور گسترده برای رشد ویروس جهت تولید برخی واکسن‌­ها استفاده می­شود.

معایب تلقیح در تخم جنین شده

• محل تلقیح برای ویروس­‌های مختلف، متفاوت است. یعنی هر ویروسی به مکان­‌های متفاوتی برای رشد و تکثیر خود نیاز دارد.

کشت سلولی (کشت بافت)

سه نوع کشت بافت وجود دارد. کشت اندام، کشت ریزنمونه و کشت سلولی.

کشت­‌های اندام عمدتاً برای انگل‌­های مربوط به اندام‌­های خاص انجام می­شود. برای مثال کشت حلقه نای برای جداسازی ویروس کرونا انجام می‌شود.

کشت ریزنمونه به ندرت انجام می­شود.

کشت سلولی بیشتر برای شناسایی و تکثیر ویروس‌ها استفاده می­شود.

• کشت سلولی فرآیندی است که طی آن سلول­‌ها تحت شرایط کنترل شده، رشد می­کنند.
• سلول­ها در شرایط آزمایشگاهی روی شیشه یا یک سطح پلاستیکی در یک محیط رشد مناسب کشت می­شوند.
• در ابتدا یک محیط رشد که معمولاً محلول نمک متعادل حاوی 13 اسید آمینه، قند، پروتئین، نمک، سرم گوساله (Calf serum)، بافر، آنتی­بیوتیک و فنول رد (Phenol red) می‌باشد، تهیه شده و بافت یا سلول میزبان در آن تلقیح می­شود.
• در انکوباسیون، تقسیم سلولی انجام و روی سطح شیشه پخش می­شود تا یک تک لایه سلولی یکنواخت (Confluent monolayer) تشکیل شود.

انواع کشت سلولی

1. کشت سلولی اولیه:

• این سلول­ها، سلول­های طبیعی هستند که از سلول­های حیوانی یا انسانی به دست می­‌آیند.
• این سلول­ها فقط برای مدت محدودی قادر به رشد هستند و نمی‌­توان آن­ها را در محیط کشت سریالی حفظ کرد.
• از این سلول­ها برای جداسازی اولیه ویروس‌ها و تولید واکسن استفاده می­شود.

برای مثال می­توان به کشت سلول کلیه میمون یا کشت سلول آمنیون انسانی اشاره کرد.

2. کشت سلولی دیپلوئید یا Diploid (خطوط سلولی نیمه پیوسته):

• این سلول­ها دیپلوئید هستند و تعداد کروموزوم­‌های مشابه سلول­‌های والد را دارند.
• این سلول­ها را می­توان تا 50 بار به وسیله انتقال سریالی قبل از این­که سویه سلولی از بین برود، زیر کشت داد.
• از این سلول­ها برای جداسازی برخی از ویروس­های سخت­‌پسند (Fastidious) و تولید واکسن­های ویروسی استفاده می­شود.
• برای نمونه می­‌توان به سویه ریه جنینی انسان و سویه سلولی جنینی میمون Rhesus اشاره کرد.

3. کشت هتروپلوئید یا Heteroploid (خطوط سلولی پیوسته):

• این سلول‌­ها از سلول­‌های سرطانی مشتق شده‌اند.
• از آنجا که آن­ها را می­‌توان به طور نامحدود به صورت سریالی کشت کرد، به عنوان رده‌های سلولی پیوسته نام­گذاری می­شوند.
• آن­ها را می­توان با زیر­کشت­‌های سریالی یا با نگه­داری در انجماد عمیق در دمای 70- درجه سانتی گراد حفظ کرد.
• به دلیل مشتق شدن از سلول‌­های سرطانی برای تولید واکسن مفید نیستند.
• نمونه­‌ها: HeLa (سرطان سلولی دهانه رحم انسانی)، HEP-2 (Humman Epithelioma مربوط به رده سلولی حنجره)، رده­های سلولی کلیه Vero (میمون Vervet)، BHK-21 (رده سلولی کلیه بچه همستر).

نمونه­‌های خطوط سلولی حساس

• هرپس سیمپلکس (Herpes Simplex) Vero Hep-2، دیپلوئید انسانی ( HEK و HEL)، آمنیون انسانی
• دیپلوئید انسانی ویروس واریسلا زوستر (VZV) (HEL, HEK)
• فیبروبلاست­‌های دیپلوئید انسانی سیتومگالوویروس(CMV)
• آدنوویروس (Adenovirus) Hep2، HEK
• فلج اطفال MK، BGM، LLC-MK2، دیپلوئید انسانی، Vero، Hep-2
• رادویوسارکوم (Rhadomyosarcoma)
• کوکساکی (Coxsackie) B MK، BGM، LLC-MK2، vero، hep-2
• اکو (Echo ) MK، BGM، LLC-MK2، دیپلوئید انسانی، Rd
• آنفولانزای A MK، LLC-MK2، MDCK
• آنفلوانزای B MK، LLC-MK2، MDCK
• پاراآنفلوآنزا (Parainfluenza) MK، LLC-MK2
• اوریون (Mumps) MK، LLC-MK2، HEK، Vero
• سین سی شیال تنفسی (RSV) Hep-2، Vero
• راینوویروس (Rhinovirus) دیپلوئید انسانی (HEK, HEL)
• سرخک MK، HEK
• سرخجه Vero، RK13

مزایای کشت سلولی

• سهولت نسبی، طیف گسترده، ارزان­تر و میزان حساسیت

مضرات کشت سلولی

• این فرآیند به تکنسین‌­های آموزش دیده با تجربه و به صورت تمام وقت نیاز دارد.
• آزمایشگاه‌­های دولتی و آزمایشگاه‌­های بیمارستانی، ویروس­‌ها را در کارهای بالینی جداسازی و شناسایی نمی­‌کنند.
• بافت یا سرم برای تجزیه و تحلیل جهت شناسایی ویروس باید به آزمایشگاه­‌های مرکزی فرستاده شود.

کشت ویروس‌­های گیاهی و باکتریوفاژها (bacteriophage)

کشت ویروس­‌های گیاهی

روش‌هایی برای کشت ویروس‌های گیاهی وجود دارد که می‌توان به کشت بافت گیاهی، کشت سلول‌های جدا شده یا کشت پروتوپلاست‌ها (Protoplast) و … اشاره کرد. ویروس‌ها را می­توان در کل قسمت­‌های گیاه کشت داد.

برگ­‌ها به صورت مکانیکی به وسیله مالش آن با ترکیبی از ویروس‌­ها و یک ساینده تلقیح می­شوند. هنگامی که دیواره سلولی توسط ساینده شکسته می‌شود، ویروس‌­ها مستقیماً در تماس با غشای پلاسما قرار می­گیرند و سلول­‌های میزبان در معرض را آلوده می­کنند. یک ضایعه نکروز موضعی اغلب به دلیل مرگ سریع سلول‌­ها در ناحیه عفونی ایجاد می­شود. برخی از ویروس‌­های گیاهی تنها در صورتی قابل انتقال هستند که قسمت آلوده به گیاه سالم پیوند زده شود.

کشت باکتریوفاژها

باکتریوفاژها در کشت‌های براث یا آگار (Broth or Agar) مربوط به سلول‌های باکتریایی جوان و فعال در حال رشد، کشت می‌شوند.

مطالب مرتبط با کشت ویروس:

کشت سلولی چیست؟ | کشت سلول و کاربردهای آن

باکتریوفاژ

منبع

مترجم: فاطمه فریادرس