کروماتوگرافی تبادل آنیونی: اصول، روش و کاربرد

فهرست مطالب نمایش

کروماتوگرافی تبادل آنیونی چیست؟

کروماتوگرافی تبادل آنیونی یک تکنیک تخصصی در کروماتوگرافی تبادل یونی (Ion exchange chromatography (IEX)) است که برای جداسازی مولکول‌ها بر اساس بار خالص سطحی آن‌ها استفاده می‌شود.

در این روش از یک رزین تبادل یونی با بار مثبت که جاذبه ذاتی را برای مولکول‌های دارای بار سطحی منفی خالص نشان می‌دهد، استفاده می‌شود. این رویکرد کروماتوگرافی کاربردهای چندگانه‌ای در زمینه‌های آماده‌سازی و تحلیلی پیدا می‌کند و جداسازی طیف متنوعی از مولکول‌ها را تسهیل می‌کند، از چیزهای کوچک مانند اسیدهای آمینه و نوکلئوتیدها (Nucleotide) تا پروتئین‌های بزرگ‌تر و پیچیده‌تر.

کروماتوگرافی تبادل آنیونی چیست؟

یک روش موثر برای خالص‌سازی انواع ترکیبات دارای بار منفی، کروماتوگرافی تبادل آنیونی است که در بیوشیمی و بیوتکنولوژی استفاده می‌شود. تکنیک کروماتوگرافی تبادل یونی از یک رزین تبادل یونی با گروه‌های دارای بار مثبت مانند گروه‌های دی‌اتیل آمینو اتیل (Diethyl-aminoethyl groups (DEAE)) استفاده می‌کند تا ترکیبات را بر اساس بار آن‌ها جدا کند.

در ابتدا، یون‌های مخالف با بار مثبت (کاتیون‌ها (Cation))، رزین را در یک محلول می‌پوشانند. هنگامی که نمونه حاوی ترکیبات هدف روی رزین اعمال می‌شود، مولکول‌های دارای بار منفی در نمونه با گروه‌های دارای بار مثبت روی رزین برهم‌کنش می‌کنند.
مولکول‌های دارای بار منفی به رزین متصل و یون‌های مخالف در نتیجه این برهم‌کنش جابه‌جا می‌شوند.
قدرت بار منفی روی مولکول‌ها، اتصال بین مولکول‌های دارای بار منفی و رزین را کنترل می‌کند.
موادی که بار منفی بیشتری دارند، اتصال قوی‌تری به رزین نشان می‌دهند، در حالی که آن‌هایی که بار منفی کمتری دارند، برهم‌کنش قوی کمتری را تجربه می‌کنند که به طور بالقوه منجر به شستشوی آسان‌تر می‌شود. دستکاری pH سیستم، امکان تعدیل قدرت بار منفی بر روی مواد هدف را فراهم می‌کند و در نتیجه بر میل ترکیبی و استحکام اتصال آن‌ها به رزین تأثیر می‌گذارد.
تحت برخی شرایط، مانند سطوح pH بالاتر، پروتئین‌ها می‌توانند یک بار منفی خالص داشته باشند. با استفاده از این بار منفی، کروماتوگرافی تبادل آنیونی امکان جداسازی انتخابی پروتئین‌های متمایز موجود در یک مخلوط را فراهم می‌کند.
کروماتوگرافی تبادل آنیونی آماده‌سازی پروتئین معمولاً در یک پیکربندی ستونی انجام می‌شود. نمونه حاوی ترکیب پروتئین در ستون حاوی رزین تبادل یونی با بار مثبت ریخته می‌شود.
پروتئین‌های موجود در نمونه که حامل بار منفی هستند، به رزین می‌چسبند و مولکول‌هایی که متصل نشده‌اند، شسته می‌شوند. متعاقباً، پروتئین‌های چسبیده را می‌توان با تغییر pH یا قدرت یونی بافر شستشو به طور خاص از رزین آزاد کرد. این روش شستشو، جداسازی و جمع‌آوری پروتئین‌های منفرد را با هدایت ویژگی‌های بار متمایز آن‌ها تسهیل می‌کند.
کروماتوگرافی تبادل آنیونی در خالص‌سازی بیومولکول‌های مختلف مانند پروتئین‌ها، اسیدهای آمینه، کربوهیدرات‌های قند و سایر ترکیبات اسیدی کاربردهای مختلفی دارد. خصوصا هنگامی که صحبت از خالص‌سازی و جداسازی پروتئین‌ها بر اساس بار خالص سطحی آن‌ها می‌شود، مفید است.
کروماتوگرافی تبادل آنیونی نه تنها برای آماده‌سازی بلکه برای کاربردهای تحلیلی نیز استفاده می‌شود. رصد پروفایل‌های شستشوی پروتئین‌ها و استفاده از روش‌های تحلیلی مانند طیف‌سنجی جرمی (Mass spectrometry) یا اسپکتروفتومتری (Spectrophotometry) برای بررسی بخش‌های شسته شده، تعیین خصوصیات و کمیت پروتئین را ممکن می‌سازد.
کروماتوگرافی تبادل آنیونی در حوزه بیوشیمی و بیوتکنولوژی بسیار مهم است و ابزاری برای جداسازی و خالص‌سازی موادی که با بارهای منفی مشخص می‌شوند، ارائه می‌دهد. تطبیق‌پذیری و کارایی این روش، آن را به یک روشی اصلی برای دانشمندانی که در زمینه‌های مختلفی از جمله خالص‌سازی پروتئین، تحقیقات دارویی و آنالیز بیوشیمیایی مشغول هستند، تبدیل می‌کند.

اصول کروماتوگرافی تبادل آنیونی

نقطه ایزوالکتریک پروتئین (Protein’s isoelectric point) یا pI تعیین می‌کند که چگونه بار خالص سطح پروتئین با pH تغییر می‌نماید. یک پروتئین زمانی که PH آن با بار جزئی آن برابر باشد، بار خالص ندارد. پروتئین در مقادیر pH کمتر از pI، دارای بار مثبت خالص است. اگر PH به بالاتر از pI پروتئین افزایش یابد، بافر دارای بار منفی خالص خواهد شد.

سپس می‌توان بافری را انتخاب کرد که بار خالص مطلوب را برای پروتئین مورد نظر تضمین می‌کند، زیرا pI پروتئین را می‌توان بر اساس توالی اسید آمینه اولیه آن تخمین زد. بنابراین، هنگامی که پروتئین مورد نظر دارای بار منفی خالص در pH اعمال شده، باشد، یک رزین تبادل آنیونی با بار مثبت انتخاب می‌شود. پروتئین‌های مختلف با قدرت‌های متفاوت به رزین متصل می‌شوند و جداسازی آن‌ها را تسهیل می‌کنند، زیرا به دلیل درجات بار متفاوت، میل ترکیبی متفاوتی برای گروه‌های سطحی با بار مثبت روی ذرات محیط تبادل آنیونی در pH معین خواهند داشت.

رزین به تمام پروتئین‌هایی که به طور مناسب باردار شده‌اند در pH خاصی از بافر اعمال شده، متصل می‌شود. به عنوان مثال، هر پروتئینی با pI کمتر از 7.5 به طور کلی دارای بار منفی خالص است و هنگامی که رزین در pH برابر 7.5 استفاده می‌شود، به رزین تبادل آنیونی با بار مثبت متصل می‌شود. سپس پروتئین مورد نظر با استفاده از یک گرادیان نمکی (Salt gradient) از سایر پروتئین‌های متصل به خود جدا می‌شود. ترتیب شستشوی پروتئین‌ها توسط بار خالص سطحی آن‌ها تعیین می‌شود. پروتئین‌هایی که با غلظت نمک بالا شسته می‌شوند، در یک قدرت یونی کمتر شسته می‌شوند، در حالی که پروتئین‌هایی با مقادیر pI نزدیک به 7.5 نیز این کار را انجام می‌دهند.

روش کروماتوگرافی تبادل آنیونی

روش زیر یک پروتکل کروماتوگرافی تبادل یونی تعمیم یافته است و شرایط اجرای خاصی از کروماتوگرافی تبادل آنیونی را می‌توان تغییر داد تا بهترین مطابقت با پروتئین مورد نظر ، سیستم بافر و رزین تبادل آنیونی انتخابی شما داشته باشد. این موضوع به این دلیل است که تمام کروماتوگرافی تبادل یونی به برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی بین گروه‌های عاملی رزین و پروتئین‌های مورد نظر وابسته است. pH بافر باید به طور دقیق تیتر (Titrate) شود و باید از یون‌های مخالف (Counterion) مناسب استفاده کرد، زیرا این عوامل تأثیر قابل توجهی بر اتصال پروتئین به رزین ستون دارند.

آماده‌سازی بافر
- قدرت یونی و pH بافر برای همه انواع کروماتوگرافی تبادل یونی یک رکن اساسی است.
- پس از تغییر غلظت نمک، بهتر است PH بافر را اصلاح کرده و از سازگاری یون‌های مخالف در بافر اطمینان حاصل کنید.
- یون‌های مخالف در بافر باید همان بار رزین را داشته باشد. برای رزین‌های تبادل آنیونی با بار مثبت، بافرهای Tris یک انتخاب ایده‌آل هستند.

متعادل‌سازی ستون
- هنگامی که مقادیر pH و رسانندگی ثابت شد، ستون را به سیستم کروماتوگرافی متصل کرده و آن را با بافر متعادل کنید.
- این امر معمولاً مستلزم حداقل پنج بار ارسال بافر از طریق ستون است.

بارگیری نمونه
- هر زمان که امکان پذیر بود، نمونه پروتئین را در بافر شروع قرار دهید.
- قدرت یونی و pH بر توانایی پروتئین برای اتصال به رزین تبادل آنیونی تأثیر می‌گذارد، بنابراین قرار دادن نمونه در بافر مناسب، کارایی اتصال را افزایش می‌دهد.
شستشوی ستون
- ستون را با لودینگ بافر (0% بافر B) بشویید تا زمانی که هیچ پروتئینی در جریان عبوری شناسایی نشود.
- معمولاً سه تا پنج حجم ستون از بافر بارگیری برای شستشوی ستون کافی است.
شستشو
- پروتئین را می‌توان با استفاده از روش شستشوی ایزوکراتیک (Isocratic elution) مرحله‌ای یا روش شستشوی گرادیان خطی استخراج کرد.
- برای بهبود شرایط شستشو، مکررا از شستشوی گرادیان استفاده می‌شود.
- هنگامی که ویژگی‌های شستشوی پروتئین مورد نظر مشخص شد و قدرت یونی یا pH که در آن یک پروتئین شسته می‌شود، مشخص شد، می‌توان از شستشوی مرحله‌ای برای تسریع فرآیند خالص‌سازی استفاده کرد.
- برای شستشوی تبادل یونی، گرادیان‌های pH اغلب بی‌اثر هستند زیرا تولید گرادیان‌های pH خطی ثابت، بدون تغییر قدرت یونی بسیار دشوار است. گرادیان‌های مرحله‌ای ممکن است نتایجی را به دست آورند که وقتی از pH برای شستشو استفاده می‌شود، با ثبات‌تر هستند.
تفکیک ستونی و تعادل
- پروتئین‌هایی که هنوز به رزین ستون متصل هستند با افزایش قدرت یونی یا تغییر pH بافر شستشو پس از شستشوی پروتئین مورد نظر، شسته می‌شوند.
- هنگامی که آخرین ذره پروتئین از رزین استخراج شد، ستون را با استفاده از یک بافر با قدرت یونی پایین متعادل کنید.
- اگر قرار است ستون به زودی مورد استفاده قرار گیرد، پس بافر راه‌اندازی برای تصفیه، تصمیم عاقلانه‌ای خواهد بود.
- برای جلوگیری از رشد میکروبیولوژیکی در طول ذخیره‌سازی طولانی مدت، جایگزینی بافر ستون با اتانول 20 درصد در آب، معمول است.

مزایای کروماتوگرافی تبادل آنیونی

کروماتوگرافی تبادل آنیونی که برای طیف گسترده‌ای از مولکول‌ها مانند پروتئین‌ها، اسیدهای نوکلئیک و سایر ترکیبات دارای بار منفی قابل استفاده است، انعطاف‌پذیری را در جداسازی و خالص‌سازی آنالیت‌های (Analyte) مختلف فراهم می‌کند.
از آن‌جا که کروماتوگرافی تبادل آنیونی به راحتی مقیاس‌پذیر است، می‌توان از آن برای تولید صنعتی در مقیاس بزرگ و مطالعات آزمایشگاهی استفاده کرد. خالص‌سازی موثر در مقیاس‌های مختلف به لطف انعطاف‌پذیری این تکنیک در انطباق با مقادیر نمونه و نرخ‌های جریان مختلف امکان‌پذیر است.
جداسازی با وضوح بالا با کروماتوگرافی تبادل آنیونی امکان پذیر می‌شود، که این موضوع خالص‌سازی مخلوط‌های پیچیده حاوی چندین ماده را ممکن می‌سازد. این امر امکان جداسازی مولکول‌های هدف را با گزینش‌پذیری و خلوص استثنایی فراهم می‌کند.
از آن‌جایی که رزین تبادل آنیونی مورد استفاده در ستون‌های کروماتوگرافی می‌تواند چندین بار بازیافت و احیا شود، مقرون به صرفه‌تر است و ضایعات کمتری تولید می‌کند.
انجام کروماتوگرافی تبادل آنیونی در محیط‌های ملایم مانند دمای اتاق و pH تقریبا خنثی امکان‌پذیر است. این امر به حفظ ساختار و فعالیت مولکول‌های حساس کمک کرده و این ملکول‌ها را با آن‌ها سازگار می‌کند.

معایب کروماتوگرافی تبادل آنیونی

مشکلات گزینش‌پذیری ممکن است هنگام تلاش برای جداسازی ترکیباتی که به طور نزدیک به هم مرتبط هستند و بارهای منفی خالص مشابهی دارند با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی ایجاد شود. در این شرایط، انتخاب رزین مناسب و تنظیم دقیق شرایط بافر برای دستیابی به بهترین جداسازی ممکن ضروری است.
بیشترین ظرفیت اتصال برای مولکول‌های هدف ممکن است توسط ظرفیت تبادل یونی رزین محدود شود. برای پردازش مقادیر یا غلظت‌های بالای نمونه، ممکن است نیاز به استفاده از ستون‌های بزرگ‌تر یا مراحل خالص‌سازی متعدد باشد.
کارایی کروماتوگرافی تبادل آنیونی وابسته به محدوده PH که با رزین انتخاب شده مطابقت دارد، می‌باشد. کاهش راندمان جداسازی می‌تواند ناشی از کاهش میل اتصال آنالیت به رزین که خارج از محدوده pH ایده‌آل است، باشد.
شرایط جذب و شستشوی کروماتوگرافی تبادل آنیونی گاهی اوقات باعث می‌شود که پروتئین‌های شکننده دناتوره (Denature) شده یا فعالیت بیولوژیکی خود را از دست بدهند. برای کاهش آسیب پروتئین، شرایط بافر دقیق و بهینه‌سازی استراتژی شستشو مورد نیاز است.
سطوح بیش از حد نمک موجود در نمونه یا بافرها ممکن است روند جداسازی را مختل کند و منجر به کاهش اثربخشی اتصال یا برهم‌کنش غیر اختصاصی با رزین شود. ممکن است انجام تعویض‌های بافر یا نمک‌زدایی به طور مناسب قبل و یا در طول فرآیند کروماتوگرافی ضروری باشد.

کاربرد کروماتوگرافی تبادل آنیونی

ظرفیت کروماتوگرافی تبادل آنیونی برای جداسازی و خالص‌سازی ترکیبات بسته به بار منفی خالص آن‌ها، این روش را در صنایع مختلف مفید می‌کند. موارد زیر چند کاربرد مهم برای کروماتوگرافی تبادل آنیونی است:

جداسازی پروتئین: پروتئین‌ها اغلب با استفاده از کروماتوگرافی تبادل آنیونی خالص و جدا می‌شوند. رزین‌های تبادل آنیونی با بار مثبت روشی موثر برای جداسازی پروتئین‌هایی هستند که دارای بار منفی خالص در pH اعمالی هستند. این روش در ساخت بیوداروها، تحقیقات پروتئین و سایر زمینه‌هایی که نیاز به جداسازی و خالص‌سازی پروتئین‌های خاص دارند، مفید است.
پروتئین‌ها اغلب با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی از مخلوط‌های خام ساخته شده از سرم خون، خالص و جدا می‌شوند. مخلوط پیچیده‌ای از پروتئین‌ها، از جمله آنزیم‌ها، آنتی‌بادی‌ها و سایر ماکرومولکول‌ها را می‌توان در سرم خون یافت. پروتئین‌هایی با بار منفی خالص در pH عملیاتی می‌توانند به طور انتخابی با استفاده از رزین تبادل آنیونی مناسب به رزین متصل شوند، در حالی که سایر اجزاء مانند نمک‌ها و ناخالصی‌ها شسته می‌شوند. سپس پروتئین‌های متصل را می‌توان از رزین آزاد کرد و با اصلاح شرایط بافر و با استفاده از روش‌های شستشو، جدا و خالص کرد. روش مذکور این امکان را برای محققان فراهم می‌کند تا پروتئین‌های خاص مورد نظر را از سرم خون جدا کنند، که این امر انجام آنالیزهای بعدی از جمله آزمایش‌های فعالیت آنزیمی، خصوصیات پروتئین، و سنتز پروتئین‌های درمانی را آسان‌تر می‌کند.
تصفیه آب: کروماتوگرافی تبادل آنیونی نقش مهمی در فرآیندهای تصفیه آب دارد. با جایگزینی یون‌های هیدروکسیل (Hydroxyl) (OH-) در رزین تبادل آنیونی به جای آنیون‌های خطرناک موجود در آب، می‌توان از این روش برای از بین بردن آن‌ها استفاده کرد. با استفاده از این روش آلاینده‌هایی از جمله نیترات‌ها، سولفات‌ها و یون‌های آرسنیک از آب آشامیدنی حذف شده و ایمنی آن برای مصرف انسان تضمین می‌شود.
جداسازی فلز: فلزات را می‌توان به طور موثر از ترکیبات پیچیده با استفاده از رزین‌های تبادل آنیونی استخراج و بازیابی کرد. فلزات معمولاً کمپلکس‌هایی با بار منفی ایجاد می‌کنند که می‌توانند به مبدل‌های آنیونی متصل شوند. فلزات خاصی را می‌توان به صورت انتخابی به رزین متصل کرد و سپس با تغییر pH و قدرت یونی به طور مستقل شستشو داد. این امر فرآیند تغلیظ و خالص‌سازی فلزات را ممکن می‌سازد. این روش در چندین زمینه مانند بازیافت فلز، آنالیز محیطی و امور معدنی مفید است.
آنالیز اسیدهای آمینه: آنالیز و کمی‌سازی اسیدهای آمینه یک کاربرد مفید کروماتوگرافی تبادل یونی است. این روش از میل‌های ترکیبی مختلفی که اسیدهای آمینه به رزین تبادل آنیون دارند برای جداسازی و شناسایی اسیدهای آمینه منفرد در یک مخلوط استفاده می‌کند. این روش به طور گسترده در تحقیقات تغذیه‌ای، مطالعات متابولیک و تعیین توالی پروتئین استفاده می‌شود.
آنالیز اسید نوکلئیک: اسیدهای نوکلئیک با بار منفی مانند DNA و RNA با استفاده از کروماتوگرافی تبادل یونی جدا و خالص می‌شوند. این روش به جداسازی قطعات خاصی از اسید نوکلئیک کمک کرده، که انجام تحقیقات بیشتر را با استفاده از روش‌هایی مانند مهندسی ژنتیک، PCR و توالی‌یابی، آسان‌تر می‌کند.
کروماتوگرافی تبادل آنیونی را می‌توان برای استخراج اسیدهای نوکلئیک مانند DNA و RNA از مخلوط‌های پیچیده‌ای که پس از مرگ سلولی به دست می‌آید، اعمال کرد. در طی این فرآیند، سایر عناصر موجود در مخلوط، مانند پروتئین‌ها و بقایای سلولی، نمی‌چسبند و شسته می‌شوند، در حالی که اسیدهای نوکلئیک با بار منفی به رزین تبادل آنیونی با بار مثبت متصل می‌شوند. اسیدهای نوکلئیک را می‌توان با شستشوی انتخابی آن‌ها و تغییر دقیق pH و قدرت یونی بافر، خالص و از مخلوط اصلی جدا کرد. پس از خالص‌سازی، این بخش اسید نوکلئیک را می‌توان برای طیف وسیعی از کاربردهای پایین‌دستی مانند مهندسی ژنتیک، PCR، و توالی‌یابی، مورد بررسی بیشتر قرار داد.

به طور خلاصه، کروماتوگرافی تبادل آنیونی دارای کاربردهای گسترده‌ای است که شامل خالص‌سازی پروتئین، آنالیز اسید آمینه، تحقیقات اسید نوکلئیک، تصفیه آب و جداسازی فلز می‌شود. تطبیق‌پذیری آن، مبتنی بر ظرفیت تفکیک مواد بر اساس بار منفی آن‌ها، این روش را به عنوان یک دارایی ارزشمند در زمینه‌های مختلف علمی، صنعتی و زیست محیطی قرار می‌دهد.

این موارد بر کارایی کروماتوگرافی تبادل آنیونی در جداسازی اسیدهای نوکلئیک از لیزهای (Lysate) سلولی و خالص‌سازی پروتئین‌ها از مخلوط‌های بیولوژیکی پیچیده مانند سرم خون تأکید می‌کند. کروماتوگرافی تبادل آنیونی با استفاده از برهم‌کنش‌های الکترواستاتیکی بین مولکول‌های دارای بار منفی و رزین تبادل آنیونی با بار مثبت، به عنوان یک ابزار قوی در کاربردهای مختلف بیوشیمیایی و بیوتکنولوژیکی ظاهر می‌شود.

همچنین بخوانید:

منبع

مترجم: صادق حسینی‌کیا

از این مطلب چقدر راضی بودید؟

روی ستاره کلیک کنید تا نظرتون ثبت بشه