پرایمر چیست؟

پرایمر چیست؟

آغازگر (پرایمر) نوعی نوکلئیک اسید تک رشته ای کوتاه است که توسط همه موجودات زنده در آغاز سنتز DNA استفاده می شود. آنزیم های مسئول تکثیر DNA ، DNA پلیمرازها ، فقط قادر به افزودن نوکلئوتید به انتهای 3’ یک اسید نوکلئیک موجود هستند ، و قبل از اینکه DNA پلیمراز یک رشته مکمل را شروع کند ، نیاز به اتصال یک آغازگر به الگو است. ارگانیسم های زنده فقط از آغازگرهای RNA استفاده می کنند ، در حالی که تکنیک های آزمایشگاهی در بیوشیمی و زیست شناسی مولکولی در شرایطی که به سنتز DNA آزمایشگاهی نیاز است از آغازگرهای DNA استفاده می کنند ، زیرا از نظر دما پایدارتر هستند.

موارد استفاده از آغازگرهای مصنوعی

آغازگرهای مصنوعی الیگونوکلئوتیدهای شیمیایی سنتز شده ای هستند که معمولاً از DNA استفاده می شوند و می توانند بصورت سفارشی در یک محل خاص روی DNA الگو قرار گیرند. در نمونه های مختلف ، آغازگر قبل از اینکه توسط DNA پلیمراز گسترش یابد ، به طور خودجوش با الگو از طریق جفت سازی پایه واتسون-کریک ترکیبی می شود. توانایی ایجاد و سفارشی سازی آغازگرهای مصنوعی ابزاری بی بدیل را که برای انواع روشهای بیولوژیکی مولکولی شامل تجزیه و تحلیل DNA لازم است ، اثبات کرده است. هر دو روش خاتمه زنجیره Sanger و روش “Next-Gen” برای تعیین توالی DNA برای آغاز واکنش به آغازگرها نیاز دارند.

طراحی آغازگر PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) از یک جفت آغازگرهای سفارشی برای هدایت طویل شدن DNA به سمت یکدیگر در انتهای مخالف توالی تقویت شده استفاده می کند. طول این آغازگرها به طور معمول بین 18 تا 24 پایه است و باید فقط برای سایت های بالادست و پایین دست خاص توالی تقویت شده کدگذاری کند. یک آغازگر که می تواند به چندین ناحیه در طول DNA متصل شود و همه آنها را تقویت کند و هدف PCR را از بین می برد.

هنگام طراحی یک جفت آغازگر PCR باید چند معیار در نظر گرفته شود. جفت آغازگرها باید از درجه حرارت ذوب مشابهی برخوردار باشند زیرا عمل annealing در حین PCR به طور همزمان برای هر دو رشته انجام می شود و این دمای ذوب مشترک نباید بیش از حد بالاتر یا پایین تر از دمای annealing واکنش باشد. یک آغازگر با Tm (دمای ذوب) خیلی بالاتر از دمای annealing واکنش می تواند ترکیبی شود و در یک مکان نادرست در امتداد توالی DNA گسترش یابد.

علاوه بر این ، توالی های آغازگر باید به طوری انتخاب شوند تا به طور منحصر به فرد برای منطقه ای از DNA  اختصاصی باشند ، و از احتمال هیبریداسیون به دنباله مشابه در نزدیکی جلوگیری کنند. روشی که معمولاً برای انتخاب یک محل مناسب برای آغازگر مورد استفاده قرار می گیرد جستجوی BLAST است که به موجب آن تمام مناطق ممکن که ممکن است یک آغازگر به آنها متصل شود دیده می شود. هر دو توالی نوکلئوتیدی و همچنین خود آغازگر را می توان BLAST جستجو کرد. ابزار رایگان NCBI Primer-BLAST ، همانند محصولات نرم افزاری تجاری مانند ePrime و Beacon Designer ، طراحی آغازگر و جستجوی BLAST را در یک برنامه ادغام می کند.

هنگام طراحی آغازگرها ، می توان پایه های اضافی نوکلئوتیدی را به انتهای پشت هر آغازگر اضافه کرد ، و در نتیجه یک ترتیب کلاهک سفارشی در هر انتهای منطقه تقویت شده ایجاد کرد. یکی از کاربردهای این روش استفاده در شبیه سازی TA است ، یک روش خاص زیرکلونینگ مشابه PCR ، که در آن می توان با افزودن دم AG به انتهای 5 “و 3” کارایی را افزایش داد.

آغازگرهای منحطط (Degenerate primers)

برخی شرایط ممکن است نیاز به استفاده از آغازگرهای منحطط داشته باشد. اینها مخلوط هایی از آغازگرها هستند که مشابه هستند ، اما یکسان نیستند. اینها ممکن است هنگام تکثیر یک ژن از موجودات مختلف مناسب باشند ، زیرا توالی ها ی آن ها احتمالاً مشابه هستند اما یکسان نیستند. این تکنیک مفید است زیرا کد ژنتیکی خود تحلیل رفته است ، به این معنی که چندین کدون مختلف می توانند اسید آمینه یکسان را کد کنند. این به ارگانیسم های مختلف امکان می دهد توالی ژنتیکی قابل توجهی متفاوت داشته باشند که پروتئین بسیار مشابه را کد می کنند. به همین دلیل ، از آغازگرهای منحطط نیز زمانی استفاده می شود که طراحی آغازگر بر اساس توالی پروتئین باشد ، زیرا توالی خاص کدون ها مشخص نیست.

آغازگرهای منحطط (Degenerate primers ) به طور گسترده ای مورد استفاده قرار می گیرند و در زمینه اکولوژی میکروبی بسیار مفید هستند. آنها امکان تکثیر ژن ها از میکروارگانیسم های تاکنون کشت نشده را فراهم می کنند و یا امکان بازیابی ژن ها را از موجوداتی که اطلاعات ژنومی در دسترس نیستند ، فراهم می کنند. معمولاً آغازگرهای منحطط با هم ترازی توالی ژنی موجود در GenBank طراحی می شوند.

در ارگانیسم های زنده ، آغازگرها رشته های کوتاه RNA هستند. قبل از تکثیر DNA ، یک آغازگر باید توسط آنزیمی به نام پریماز که نوعی RNA پلیمراز است ، سنتز شود. سنتز یک آغازگر ضروری است زیرا آنزیم هایی که DNA را سنتز می کنند و DNA پلیمرازها نامیده می شوند ، فقط می توانند نوکلئوتیدهای DNA جدید را به یک رشته نوکلئوتید موجود متصل کنند. بنابراین پرایمر در خدمت تولید و پایه ریزی برای سنتز DNA است. آغازگرها قبل از تکثیر DNA حذف می شوند و شکافهای توالی با DNA توسط پلیمرازها پر می شود. در آزمایشگاه ، دانشمندان می توانند آغازگرهای DNA را با توالی های خاص که به توالی های یک مولکول DNA تک رشته متصل می شوند ، طراحی و سنتز کنند. این آغازگرهای DNA معمولاً برای انجام واکنش زنجیره ای پلیمراز برای کپی کردن قطعات DNA یا تعیین توالی DNA استفاده می شود.

دوره کارآموزی ژنتیک مولکولی

آزمایشگاه ژنتیک مولکولی ژنیران

خدمات آزمایشگاه ژنتیک مولکولی ژنیران