فریز کردن سلول های جانوری

• به منظور زنده نگه داشتن سلول ها به صورت طولانی مدت ، سلولها باید فریز شده و در دمای -۱۹۶ درجه سانتی گراد نگه داری شوند.
• بدین صورت که سلول های موجود در فلاسک به داخل یک فالکون انتقال داده میشوند.
• پس از سانتریفیوژ با دور ۱۵۰۰ آر پی ام به مدت ۳ الی ۵ دقیقه، رسوب سلولی ته فالکون تشکیل می گردد.
• پس از خروج مایع رویی، فریزینگ مدیا که شامل fbs و dmso می باشد بر روی رسوب سلولی ریخته شده و پیپتاژ می گردد.
• مقادیر fbs و dmso بر اساس نوع رده سلولی مشخص می شود.
• بعد از نوشتن تاریخ و نام رده سلولی، سلولها به کرایوویال انتقال می یابند.
• ابتدا کرایوویال درفریزر منفی ۲۰ درجه به مدت ۲ ساعت قرار داده میشود.
• سپس برای یک شب در فریزر منفی ۷۰ درجه قرار میگیرد.
• در نهایت به تانک ازت مایع منتقل شده و برای مدتهای طولانی به صورت زنده نگه داشته می شوند.

تکنیک فریز کردن سلول های جانوری

رده های سلولی در کشت دائمی احتمالاً از نتایج نامطلوب مانند رانش ژنتیکی، پیری و آلودگی میکروبی رنج می برند و حتی آزمایشگاه هایی با بهترین عملکرد نیز نمی توانند از این مسائل جلوگیری کنند. رده سلولی مستقر یک منبع با ارزش است و جایگزینی آن گران و پرهزینه است. بنابرای ، بسیار حیاتی است که آنها را فریز و به مدت طولانی حفظ کرد. بانک مناسب سلولهای یخ زده بخش مهمی از آزمایگاه موفق کشت سلولی است.

روش انجماد عمومی برای سلولهای چسبنده و معلق یکسان است، با این تفاوت که سلولهای چسبنده قبل از شروع انجماد باید از کف فلاسک کشت جدا شوند. بهترین روش برای محافظت از انجماد سلولهای كشت شده، ذخیره آنها در بخار نیتروژن مایع در محیط كامل و با حضور ماده محافظت كننده ای مانند دی متیل سولفوكسید (DMSO) است.

عوامل محافظت کننده انجماد باعث کاهش دمای انجماد محیط می شوند و خطر تشکیل کریستال یخ را تا حد زیادی کاهش می دهد که می تواند به سلول ها آسیب برساند و باعث مرگ سلول شود.

محیط انجماد

همیشه از محیط انجماد توصیه شده برای محافظت از سلول های خود استفاده کنید. محیط انجماد باید حاوی ماده محافظتی مانند DMSO یا گلیسرول باشد.

مواد و تجهیزات مورد نیاز

• ظروف کشت حاوی سلولهای کشت داده شده در مرحله رشد
• محیط رشد كامل
• ماده محافظت کننده مانند DMSO
• لوله فالکون یکبار مصرف، استریل ۱۵ میلی لیتری یا ۵۰ میلی لیتری
• معرفها و تجهیزات برای تعیین تعداد سلولهای زنده
• کرایوویال
• تانک ازت
• Trypsin (برای سلول های چسبنده)
• فریزر ۸۰-

پروتکل

1. مواد انجماد را آماده کرده و در دمای ۲ تا ۸ درجه سانتیگراد تا زمان استفاده نگهداری کنید. توجه داشته باشید که محیط انجماد مناسب به سلول بستگی دارد.
2. برای رده های چسبنده، با تریپسین سلول ها را از کف جدا کرده سپس با محیط کشت کامل، تریپسین را خنثی و معلق کنید.
3. تعداد کل سلول ها و درصد زنده ماندن را با استفاده از لام هموسیتومتر، شمارنده سلول و Trypan Blue تعیین کنید. با توجه به تراکم سلولی قابل استفاده، حجم مورد نیاز محیط انجماد را محاسبه کنید.
4. برای ۵ تا ۱۰ دقیقه محیط معلق حاوی سلول را در ۱۵۰۰ دور در دقیقه ساتریفیوژ کنید کنید. سپس بدون ایجاد مزاحمت برای پلت سلولی محیط رویی را خارج کنید.
5. پلت سلولی را در محیط فریز سرد مناسب معلق کنید.
6. پس از انجام پیپتاژ، مخلوط همگن را به کرایوویال انتقال دهید.
7. سلول ها را ۱ ساعت در فریزر ۲۰-، سپس یک روز در فریزر ۸۰- و بعد از آن به تانک ازت انتقال دهید.

• دوره مهارت آموزی کشت سلولی
• خدمات آزمایشگاهی بخش کشت سلول
• تجهیزات آزمایشگاهی ژنیران