مقدمه‌ای بر لیگاسیون ژن با وکتور در کلونینگ
لیگاسیون ژن با وکتور یکی از مراحل اصلی در فرآیند کلونینگ ژنی است که به کمک آن می‌توان یک ژن خاص را به یک وکتور (معمولاً پلاسمید) منتقل کرده و سپس آن را در یک سلول میزبان مانند باکتری‌ها، مخمرها یا سلول‌های یوکاریوتی تکثیر و مطالعه کرد. این فرآیند به محققان این امکان را می‌دهد که ژن‌های خاصی را برای اهداف مختلف مانند تولید پروتئین‌های نوترکیب، بررسی عملکرد ژن‌ها، ساخت داروها یا درمان‌های ژنتیکی، و همچنین انجام تحقیقات بنیادی در زمینه‌های مختلف علوم زیستی از جمله ژنتیک، بیوتکنولوژی، و داروسازی، مورد استفاده قرار دهند.
برای آغاز فرآیند لیگاسیون، ابتدا نیاز است که دو مولکول DNA، یکی از آن‌ها ژن هدف و دیگری وکتور، به طور صحیح و با دقت به یکدیگر متصل شوند. برای این کار، هر دو مولکول DNA باید در نقاط خاصی به یکدیگر متصل شوند که این اتصال به کمک آنزیم‌های خاصی انجام می‌شود. این آنزیم‌ها معمولاً از نوع لیگازها هستند که وظیفه اتصال فسفات و قند را در محل برش‌های دو رشته DNA دارند. در این فرایند، وکتور باید دارای مکان‌های ویژه‌ای برای برش به وسیله آنزیم‌های محدودکننده (Restriction Enzymes) باشد تا این امکان را فراهم کند که ژن مورد نظر در محل مناسب داخل وکتور قرار گیرد.
در اولین گام، وکتور و ژن هدف باید با استفاده از آنزیم‌های محدودکننده مناسب برش داده شوند. این آنزیم‌ها هرکدام به صورت خاص به توالی‌های خاصی در DNA شناسایی شده و باعث برش در آن‌ها می‌شوند. این برش‌ها معمولاً به گونه‌ای هستند که انتهای برش خورده DNA حالت چسبندگی داشته باشند و بتوانند به راحتی با یکدیگر پیوند برقرار کنند.
در این مرحله، باید دقت زیادی داشته باشیم که آنزیم‌های محدودکننده انتخابی نه تنها ژن هدف بلکه وکتور را در جای مناسب برش دهند. در برخی موارد ممکن است نیاز به استفاده از آنزیم‌هایی باشد که فقط یک طرف ژن یا وکتور را برش دهند و دیگر طرف آن را بدون تغییر باقی بگذارند، این کار به تنظیم دقیق برش‌ها و در نهایت سازگاری بهتر DNAهای مختلف با یکدیگر کمک می‌کند.
پس از برش وکتور و ژن، مرحله بعدی، افزودن آنزیم لیگاز به محل برش‌ها است. آنزیم لیگاز باعث ایجاد پیوند فسفودی استر بین قند و فسفات در انتهای برش‌ها می‌شود و به این ترتیب، دو مولکول DNA به یکدیگر متصل می‌شوند. این پیوند محکم باعث می‌شود که ژن هدف به وکتور پیوسته و یک مولکول DNA جدید، که حاوی ژن هدف درون وکتور است، شکل بگیرد. فرآیند لیگاسیون ممکن است با موفقیت تمام نشود و برخی از واکنش‌ها منجر به اتصال‌های ناخواسته یا عدم اتصال کامل ژن به وکتور شوند. به همین دلیل، پس از انجام لیگاسیون، باید از روش‌های مختلفی برای انتخاب کلون‌های موفق استفاده کرد.
برای شناسایی کلون‌های موفق، از روش‌های مختلفی استفاده می‌شود. یکی از متداول‌ترین روش‌ها استفاده از آنتی‌بیوتیک انتخابی است. بسیاری از وکتورها دارای ژن‌های مقاوم به آنتی‌بیوتیک هستند. در این صورت، تنها سلول‌هایی که وکتور و ژن هدف را به درستی در خود وارد کرده‌اند، قادر خواهند بود در محیطی که حاوی آنتی‌بیوتیک است رشد کنند. به این ترتیب، سلول‌های باکتری که حاوی وکتور غیرموتیف یا ژن هدف نشده‌اند، قادر به رشد در محیط آنتی‌بیوتیکی نخواهند بود و تنها کلون‌هایی که موفق به لیگاسیون شده‌اند، رشد می‌کنند.
یکی دیگر از روش‌های انتخابی استفاده از ویژگی‌های خاص وکتور است. برخی وکتورها دارای توالی‌هایی هستند که در صورت وارد شدن ژن هدف، عملکرد آن‌ها تغییر می‌کند. به عنوان مثال، در وکتورهای مبتنی بر لاکتاز (lacZ)، اگر ژن هدف در ناحیه خاصی از ژن لاکتاز قرار گیرد، قادر به تجزیه لاکتوز نخواهد بود و این تغییرات قابل شناسایی است. برای شناسایی کلون‌های موفق، معمولاً از روش‌های رنگ‌سنجی مانند استفاده از X-gal یا IPTG استفاده می‌شود که به شناسایی کلون‌های باکتری با ویژگی‌های مطلوب کمک می‌کند.
پس از شناسایی کلون‌های موفق، مرحله بعدی انتقال DNA اصلاح‌شده به سلول‌های میزبان است. این سلول‌ها می‌توانند باکتری‌ها یا سایر ارگانیسم‌ها باشند که می‌توانند ژن هدف را درون خود تکثیر کنند. برای این منظور، معمولاً از روش‌های ترانسفورمیشن یا ترانزفکشن استفاده می‌شود. در روش ترانسفورمیشن، DNA به سلول‌های باکتری از طریق تغییرات فیزیکی مانند شوک حرارتی یا الکتروپوریشن وارد می‌شود. در روش ترانزفکشن، برای انتقال DNA به سلول‌های یوکاریوتی از روش‌های شیمیایی یا فیزیکی خاص استفاده می‌شود.
پس از انتقال DNA به سلول‌های میزبان، باید منتظر بمانیم تا این سلول‌ها بتوانند DNA وارد شده را تکثیر کنند و ژن هدف به میزان کافی تولید شود. در برخی موارد، ممکن است نیاز باشد که شرایط کشت یا القای خاصی برای بیان ژن هدف فراهم شود. مثلاً در سیستم‌های بیان پروتئین، ممکن است نیاز به استفاده از القا کننده‌هایی مانند IPTG برای تحریک بیان پروتئین باشد.
در نهایت، برای بررسی نتایج، از روش‌های مختلفی برای تایید حضور و بیان ژن هدف استفاده می‌شود. این روش‌ها می‌توانند شامل تحلیل‌های مولکولی مانند PCR، بررسی پروتئین‌های تولید شده به کمک تکنیک‌هایی مانند وسترن بلات، و یا آنالیزهای فنوتیپی مانند ارزیابی ویژگی‌های فیزیولوژیکی یا بیوشیمیایی باشند. این مرحله بسیار مهم است زیرا صحت و دقت فرآیند کلونینگ را تایید می‌کند.
در نتیجه، لیگاسیون ژن با وکتور یکی از مراحل حساس و حیاتی در فرآیند کلونینگ ژنی است که نیازمند دقت بالا در انتخاب آنزیم‌ها، شرایط آزمایشگاهی و انتخاب کلون‌های موفق است. این فرآیند در تحقیقات علمی و صنعتی در زمینه‌های مختلف از جمله داروسازی، تولید پروتئین‌های نوترکیب، و مطالعه عملکرد ژن‌ها کاربردهای وسیعی دارد و به پیشرفت‌های علمی و پزشکی کمک بسیاری کرده است.
همچنین بخوانید:
