قالب گیری و جاسازی و پردازش بافت

قالب گیری و جاسازی : پس از پردازش بافت، مرحله بعدی جاسازی بافت برای ساخت بلوک است. در فرآیند جاسازی، بافت با استفاده از یک قالب در یک محیط مذاب احاطه می شود. متعاقباً این محیط جامد می شود تا بلوکی برای برش بخش نازک بافت ایجاد شود.

اهداف جاسازی: محیط جاسازی سه عملکرد مهم دارد:

1. برای حمایت از بافت
2. برای جلوگیری از اعوجاج بافت در حین برش
3. برای حفظ بافت برای استفاده آرشیوی

انتخاب محیط جاسازی: از محیط های مختلفی برای جاسازی استفاده می شود مانند موم پارافین، رزین اپوکسی، متاکریلات، کربووکس و غیره.

موم پارافین متداول ترین ماده جاسازی است. انتخاب محیط جاسازی به عوامل زیر بستگی دارد:

1. نوع بافت: تراکم بافت و محیط جاسازی باید نزدیک باشد در غیر این صورت ممکن است بافت به درستی برش داده نشود و بافت تغییر شکل دهد.
2. نوع میکروتوم
3. نوع میکروسکوپ

تکنیک اصلی تعبیه صرف نظر از محیط جاسازی یکسان است.

3.1 جاسازی رسانه

(الف) موم پارافین: همانطور که در فصل قبل توضیح داده شد، موم پارافین یک هیدروکربن جامد پلی کریستالی است. موم پارافین در بازار با نقطه ذوب متفاوتی به فروش می رسد. موم پارافین با نقطه ذوب بین 56 تا 62 درجه سانتیگراد در آزمایشگاه ما استفاده می شود. موم پارافین ارزان تر و آسان تر است. نظارت کمی برای مسدود کردن آن مورد نیاز است.

(ب) رزین اپوکسی: رزین اپوکسی عمدتاً در میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود زیرا وضوح بهتر و جزئیات بیشتری از بافت ارائه می دهد.

(ج) محیط اکریلیک: مونومر متاکریلات با اتانول قابل اختلاط است. در حضور کاتالیزور (بنزوئیل پراکسید 2%)، مونومر متاکریلات پلیمریزه شده و یک بلوک سخت و شفاف ایجاد می کند. مونومر متاکریلات همراه با هیدروکینون در بازار موجود است که باید با محلول قلیایی ضعیف و سپس شستشوی کامل با آب حذف شود. وجود آب ممکن است منجر به ایجاد حباب های کوچک در داخل بلوک شود.

د) ژل آگار: ژل آگار به انسجام بافت شکننده و تکه تکه شده به ویژه در نمونه سیتولوژی و همچنین کیورت کردن آندومتر و بیوپسی های آندوسکوپی کوچک کمک می کند. برای برش بخش پشتیبانی خوبی از بافت ایجاد نمی کند. روش تعبیه دوگانه موم آگار-پارافین نسبت به آگار به تنهایی روش مناسب تری است.

ه) ژلاتین: همچنین در بافت‌های کوچک شکننده و بخش منجمد حاوی بافت‌های شکننده و نکروزه استفاده می‌شود. نقطه ذوب ژلاتین 35 تا 40 درجه سانتی گراد است و این نقطه ذوب پایین آن را برای جاسازی نامناسب می کند.

(و) محیط سلوئیدین: سلوئیدین نیتروسلولزی است و عمدتاً برای جاسازی بافت سخت استفاده می شود. امروزه در آزمایشگاه استفاده نمی شود.

صاف و صیقلی است که به حذف پارافین مایع کمک می کند. قالب را می توان با یک حلقه پلاستیکی پوشاند. قالب پلاستیکی در اینجا قالب از پلاستیک مقاوم در برابر مواد شیمیایی ساخته شده است (شکل 3.3).

3.3 روش جاسازی بافت

روش جاسازی بافت اساساً برای همه انواع رسانه های جاسازی یکسان است. موارد زیر برای بافت مورد نیاز است

تعبیه کردن:

1. موم پارافین مذاب
2. با روکش قالب بزنید
3. صفحه فلزی (صفحه سرد) برای کار

امروزه سیستم های تجاری با اجزای مختلف در کنار هم وجود دارد [1].

سیستم Tissue-Tek ترکیبی از (شکل 3.4) است:

1. پخش کننده پارافین مایع در دمای ثابت
2. یک صفحه فلزی برای ساخت بلوک بافت
3. بشقاب سرد

سیستم Tissue-Tek I: مراحل این سیستم عبارتند از (شکل 3.5):

• پارافین مایع در دمای ثابت در دیسپنسر سیستم نگهداری می شود.
• بافت توسط فورسپس در سطح زیرین قالب قرار می گیرد. سطح برش باید رو به پایین باشد.
• پارافین مذاب روی قالب فلزی ریخته می شود.
• قالب با حلقه پلاستیکی محیطی در سطح بالایی پوشیده شده است.
• شماره بافت منحصر به فرد در یک گوشه قرار داده شده است.
• کل قالب روی بشقاب سرد قرار می گیرد.
• قالب فلزی از حلقه پلاستیکی جدا شده و از بلوک برای برش بافت استفاده می شود.

Tissue-Tek System II مراحل اساسی Tissue-Tek II مشابه همان چیزی است که در بالا توضیح داده شد. در این سیستم به جای قالب فلزی از قالب پلاستیکی برای نگهداری پارافین مایع استفاده می کنیم.

 

3.4 جهت گیری و جاسازی بافت

جهت گیری صحیح بافت برای برش مناسب و بررسی میکروسکوپی بسیار مهم است. بافت معمولاً به صورت صاف در قسمت مرکزی قالب قرار می گیرد. جهت گیری آن باید به گونه ای باشد که برش با چاقوی میکروتوم آسان باشد. برخی از بافت ها به مراقبت ویژه نیاز دارند که در زیر توضیح داده شده است (شکل 3.6):

1. بافت لوله ای (لوله فالوپ، اختلاف عروق، شریان و …) باید به گونه ای قرار گیرد که با تمام لایه ها یک مقطع عرضی داشته باشیم.
2. بافت با سطح اپیتلیال باید به صورت عمودی و با زاویه مناسب نسبت به سطح قرار داده شود تا بتوانیم تمام لایه ها را بدست آوریم.
3. چندین بخش از بافت مانند کرتینگ آندومتر باید در موقعیت مرکزی قرار گیرد.
4. بافت بلند خطی باید به صورت مورب قرار گیرد.
5. بیوپسی عضله باید در هر دو سطح طولی و عرضی قرار گیرد.
6. بافت غشایی بلند مانند غشای آمنیوتیک باید به عنوان رول سوئیسی ساخته شود. 3.5 علامت گذاری بافت [2] علامت گذاری بافت با جوهر برای اهداف زیر مورد نیاز است:
7. برای شناسایی صفحه برداشتن یا حاشیه بیرونی بافت
8. برای کمک به جاسازی بافت

3. هر ناحیه مورد علاقه برای شناسایی مانند ناحیه انتقالی در بیوپسی مخروطی دهانه رحم.

هنگامی که بافت ثابت شد، باید به شکلی پردازش شود که بتوان آن را به بخش های میکروسکوپی نازک تبدیل کرد. روش معمول این کار با پارافین است. بافت‌های تعبیه‌شده در پارافین، که از نظر چگالی مشابه بافت هستند، می‌توانند در هر نقطه‌ای از 3 تا 10 میکرون، معمولاً 6 تا 8 میکرون برش داده شوند. تکنیک تبدیل بافت ثابت به پارافین، پردازش بافت نامیده می شود. مراحل اصلی در این فرآیند کم آبی و پاکسازی است.

 

بافت های ثابت مرطوب (در محلول های آبی) نمی توانند مستقیماً با پارافین نفوذ کنند. ابتدا باید آب از بافت ها با کم آبی خارج شود. این معمولاً با یک سری الکل انجام می شود، مثلاً 70٪ تا 95٪ تا 100٪. گاهی اوقات اولین مرحله مخلوط فرمالین و الکل است. سایر خشک کن ها را می توان استفاده کرد، اما دارای معایب عمده ای هستند. استون بسیار سریع است، اما خطر آتش سوزی است، بنابراین فقط برای مجموعه های کوچک و دستی از بافت ها بی خطر است. دی اکسان را می توان بدون پاکسازی استفاده کرد، اما دارای بخارات سمی است.

 

مرحله بعدی “پاکسازی” نامیده می شود و شامل حذف ماده خشک کننده با ماده ای است که با محیط جاسازی (پارافین) قابل اختلاط خواهد بود. رایج ترین عامل پاک کننده زایلن است. تولوئن به خوبی کار می کند و نسبت به مقدار کمی آب باقی مانده در بافت ها تحمل بیشتری دارد، اما 3 برابر گران تر از زایلن است. قبلاً از کلروفرم استفاده می شد، اما برای سلامتی مضر است و کند است. متیل سالیسیلات به ندرت استفاده می شود زیرا گران است، اما بوی خوبی دارد (روغن زمستان سبز است).

 

عوامل پاکسازی جدیدتری برای استفاده در دسترس هستند. بسیاری از آنها بر پایه لیمولن هستند، روغن فراری که در پوست مرکبات یافت می شود. دیگری از هیدروکربن های آلیفاتیک با زنجیره بلند (Clearite) استفاده می کند. اگرچه آنها خطر کمتری برای سلامتی دارند، اما با بافت‌های ضعیف، کم‌آبی یا برش‌خورده، کمتر بخشنده هستند.

 

در نهایت، بافت با عامل تعبیه‌کننده، تقریباً همیشه پارافین، نفوذ می‌کند. بسته به نوع علاقه هیستوتکنولوژیست و آب و هوا (گرم در مقابل سرد) می توان پارافین هایی را خریداری کرد که در نقطه ذوب متفاوت هستند، برای سختی های مختلف. محصولی به نام پاراپلاس حاوی نرم کننده های اضافه شده است که برش بلوک های پارافین را برای برخی تکنسین ها آسان تر می کند. برای کمک به نفوذ عامل تعبیه‌کننده، می‌توان یک خلاء را در داخل پردازشگر بافت اعمال کرد.

 

فرآیندهای فوق تقریباً همیشه برای حجم زیادی از بافت‌های معمولی پردازش شده خودکار هستند. اتوماسیون شامل ابزاری است که بافت ها را از طریق عوامل مختلف در یک مقیاس زمانی از پیش تعیین شده حرکت می دهد. پردازشگر بافت “تکنیکون” یکی از رایج ترین و قابل اطمینان ترین ها است (پردازنده مکانیکی با موتور الکتریکی که چرخ دنده ها و بادامک ها را به حرکت در می آورد)، اگرچه دیگر ساخته نشده است. پردازنده‌های جدیدتر دارای رایانه‌هایی هستند، نه چرخ‌های بادامک، تا آنها را کنترل کنند و دارای چاه‌های معرف مهر و موم شده‌اند که می‌توان به آنها خلاء و/یا گرما اعمال کرد.

 

پردازشگر بافت

پردازشگر بافت خودکار

دستمال‌هایی که از پردازشگر بافت جدا می‌شوند هنوز در کاست‌ها هستند و باید توسط تکنسین به‌طور دستی داخل بلوک‌ها قرار داده شوند و باید دستمال‌ها را از کاست بیرون بیاورند و پارافین مذاب را روی آن‌ها بریزند. این فرآیند “جاسازی” بسیار مهم است، زیرا بافت ها باید به درستی در بلوک پارافین تراز یا جهت گیری شوند.

 

تعبیه بافت.

جایگزین‌های جاسازی پارافین شامل پلاستیک‌های مختلفی است که به بخش‌های نازک‌تر اجازه می‌دهد. این گونه پلاستیک ها عبارتند از متیل متاکریلات، گلیکول متاکریلات، آرالدیت و اپون. متیل متاکریلات بسیار سخت است و به همین دلیل برای جاسازی استخوان غیرکلسی شده خوب است. گلیکول متاکریلات بیشترین کاربرد را دارد زیرا کار با آن ساده ترین است. آرالدیت تقریباً مشابه متاکریلات است، اما به فرآیند تعبیه پیچیده تری نیاز دارد. Epon به طور معمول برای میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود که در آن بخش های بسیار نازک مورد نیاز است.

 

پلاستیک ها به معرف های خاصی برای خشک شدن و پاکسازی نیاز دارند که گران هستند. به همین دلیل و به دلیل اینکه تعداد کمی از بافت ها پلاستیکی تعبیه شده است، پردازش معمولاً با دست انجام می شود. یک میکروتوم مخصوص برای برش این بلوک ها مورد نیاز است. بلوک‌های کوچک باید ساخته شوند، بنابراین این تکنیک به نمونه‌برداری‌های کوچک مانند مغز استخوان یا کبد کمک می‌کند.