فیلترهای نوری در فلوسایتومتری و استفاده از آن

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر فیلترهای نوری در فلوسایتومتری

فلوسایتومتری یک روش با توان بالا برای آنالیز سلولی است که در آن سلول‌های زنده در یک فایل توسط مجموعه‌ای از لیزرها و آشکارسازها بررسی می‌شوند. درجه پراکندگی نور لیزر را می توان برای استنباط بخش قابل توجهی از اطلاعات مربوط به سلول مانند اندازه، چگالی، مورفولوژی و وضعیت آپوپتوز استفاده کرد و در ترکیب با تکنیک های دیگر مانند سلول های رنگ آمیزی فلورسنت می توان از آن استفاده کرد.

فلوروفورها نور با طول موج خاصی را جذب می‌کنند و متعاقباً در طول موج خاصی ساطع می‌کنند، بنابراین می‌توان از چندین فلوروفور به طور همزمان برای برجسته کردن چندین ساختار سلولی بدون تداخل با یکدیگر استفاده کرد. نور با طول موج های چندگانه ممکن است به سلول های عبوری در آرایش موازی یا هم خطی تحویل داده شود، جایی که نور پراکنده شده توسط آشکارسازهای متعدد که هر کدام مسئول محدوده خاصی از طول موج هستند، دریافت می شود.

نور ممکن است توسط سلول به سمت جلو، پهلو یا عقب پراکنده شود که هر کدام برای استنباط ویژگی های مختلف استفاده می‌شوند. به عنوان مثال، همانطور که بیشتر نور از سلول عبور می‌کند و تحت انکسار قرار می‌گیرد، از نور پراکنده به سمت جلو برای تعیین اندازه سلول استفاده می‌شود، در حالی که نور پراکنده جانبی متناسب با پیچیدگی داخلی سلول است و فوتون ها توسط اندامک ها منعکس می‌شوند.

بنابراین، همه آشکارسازها باید با یک زاویه برخورد بسیار خاص تراز شوند و برای اطمینان از اینکه نور با طول موج مناسب به آشکارساز صحیح می‌رسد، ابتدا باید از یک سری فیلتر عبور کند.

این فیلترها به یک محدوده پیوسته یا یک سری از طول موج های خاص اجازه عبور می دهند در حالی که تمام نورهای دیگر را با زاویه 45 درجه به یک آشکارساز مجاور منعکس می‌کنند، یا ممکن است از آینه ها برای هدایت نور به سمت آشکارساز استفاده شود، جایی که فیلترها مستقیماً روی دیافراگم قرار می‌گیرند.

فیلترهای نوری دو رنگ چیست؟

فیلترها، آینه‌ها و آشکارسازهای مورد استفاده در فلوسایتومتری باید به دقت انتخاب شوند و در عین حال فلوروفورهای مورد استفاده برای رسیدن به انتقال سیگنال و تشخیص بهینه و در عین حال کاهش نویز پس‌زمینه در نظر گرفته شوند. آشکارسازها بر اساس تبدیل فوتون به الکترون برای تولید سیگنال الکتریکی هستند و شدت سیگنال الکتریکی تولید شده با تعداد فوتون هایی که به آشکارساز می‌رسند نسبت مستقیم دارد.

با این حال، آشکارسازها نمی‌توانند به راحتی بین نور با طول موج های متفاوت تمایز قائل شوند، و بنابراین ضروری است که محدوده نوری را که به آشکارساز می‌رسد نسبت به آنهایی که با طول موج انتشار فلوروفور مورد استفاده مرتبط هستند، محدود کنیم. این تضمین می‌کند که نور ساطع شده از سایر فلوروفورها به اشتباه توسط آشکارساز شمارش نمی‌شود و به طور قابل توجهی نویز پس زمینه دریافت شده توسط آشکارساز را کاهش می‌دهد.

فیلترها و آینه‌های ترکیبی که به طول موج‌های خاصی اجازه عبور می‌دهند در حالی که بقیه را منعکس می‌کنند، فیلترهای دو رنگ یا آینه دو رنگ نامیده می‌شوند. فیلترهای دو رنگی که به تمام نورهای بالای یک طول موج خاص اجازه عبور می دهند، فیلترهای گذر طولانی (دارای طول موج بلندتر) نامیده می‌شوند، در حالی که فیلترهایی که نور زیر یک طول موج خاص را مجاز می‌کنند، فیلترهای کوتاه گذر نامیده می‌شوند.

به عنوان مثال، فیلترهای نوری گذر طولانی (Longpass filters) 450 نانومتر نور بنفش را منحرف می‌کند و اجازه عبور آبی، سبز و زرد را می‌دهد، در حالی که فیلترهای نوری کوتاه گذر (Shortpass filters) 450 نانومتری به نور بنفش اجازه عبور می‌دهد و طول موج های طولانی تری را منحرف می‌کند. آشکارسازهای باند گذر درعوض به طیفی از طول موج‌های نور اجازه می‌دهند که در یک طول موج خاص از آن عبور کنند و انتهای آن را حذف می‌کنند، برای مثال، یک فیلتر 520 ± 30 نانومتر به محدوده 60 نانومتری از طول موج‌ها با مرکز 520 نانومتر اجازه عبور می‌دهد.

برعکس، آینه‌های دو رنگ با طول موج‌های نوری که منعکس می‌کنند مشخص می‌شوند، نه آن‌هایی که اجازه عبور از آن‌ها را می‌دهند، و سمت آینه‌ای فیلترهای مورد استفاده در فلوسایتومتری فرصت دیگری برای اصلاح طول موج‌های نوری است که به آشکارساز می‌رسد.

فیلترهای دورنگ در مقایسه با فیلترهای نوری مبتنی بر رنگ سنتی مزایای متعددی دارند و پس از استفاده مکرر دچار سفید شدن نمی شوند. علاوه بر این، از آنجایی که نور فیلتر نشده به جای جذب منعکس می‌شود، فیلتر در حین استفاده گرم نمی‌شود و اجازه می‌دهد از نور شدیدتری استفاده شود.

فیلترهای نوری دو رنگ چگونه کار می‌کنند؟

آینه‌ها یا فیلترهای دو رنگ از صفحه‌هایی از لایه‌های نازک دی‌الکتریک متصل به شیشه ساخته می‌شوند که نور فرودی را بر اساس طول موج نور ورودی به‌طور متفاوتی شکست می‌دهند، به همان روشی که منشورهای شیشه‌ای قادر به جداسازی نور سفید هستند. چندین لایه از لایه‌های با ضریب شکست بالا و پایین، که کم و بیش شدید می‌شکنند، باعث می‌شوند نور فرودی سرعت را در مرز هر لایه تغییر دهد.

ضخامت و فاصله بین لایه ها به گونه ای طراحی شده است که نور طول موج های مورد نظر را در فاز نگه می دارد و تداخل سازنده ایجاد می کند، در حالی که نوری که نمی خواهید از فیلتر عبور کند با تداخل مخرب حذف می شود. آینه‌های دی‌الکتریک به‌طور یکسان عمل می‌کنند، همانطور که نور فرودی به مرز بین هر لایه برخورد می کند، بخشی به جای عبور منعکس می شود و تنها نور با طول موج مورد نظر تحت تداخل سازنده قرار می گیرد.

همچنین بخوانید: