مقدمه‌ای بر فلوسایتومتری در مهندسی پروتئین
فلوسایتومتری یک ابزار تحلیلی مفید است که می‌تواند ویژگی‌های سلول‌ها را در یک جمعیت تشخیص دهد. این تکنیک برای اهداف متعدد مورد استفاده قرار می‌گیرد و این مقاله به نحوه استفاده از آن در مهندسی پروتئین می‌پردازد.
فلوسایتومتری چیست؟
فلوسایتومتری سلول‌ها یا ذرات معلق را با جداسازی آنها در جریانی باریک و سریع از مایع شناسایی می‌کند. نمونه از مقابل لیزر عبور داده می‌شود که ویژگی‌هایی مانند اندازه، تعداد ذرات یا سلول‌ها،پیچیدگی و فلورسانس را تشخیص می‌دهد. نشانگرهای فلورسنت، معمولاً آنتی‌بادی‌هایی با برچسب فلورسنت هستند که در آزمایش‌های فلوسایتومتری استفاده می‌شوند و می‌توانند اطلاعاتی در مورد فرآیندهای سلولی و به عنوان مثال، زنده یا مرده بودن یک سلول ارائه دهند.
نمونه‌های برچسب‌دار فلورسنت به فلوسایتومتر متصل می‌شوند و با تمرکز هیدرودینامیکی با جریان نازکی از مایع احاطه شده توسط “غلاف” سیال با حرکت سریع هدایت می‌شوند. یک لیزر (یا چندین لیزر) بر روی این جریان مایع متحرک متمرکز است و آشکارسازها در همان نقطه‌ای هستند که پراکندگی رو به جلو، پراکندگی جانبی و مولکول‌های فلورسنت را شناسایی می‌کنند.
نوسانات روشنایی در پیک انتشار فلورسانس توسط نرم افزار شناسایی و تجزیه و تحلیل می‌شود که داده‌هایی را در مورد خواص ذرات ارائه می‌دهد. جمع آوری داده‌های نمونه “acquisition” نامیده می‌شود و نرم افزار مورد استفاده می‌تواند پارامترهایی مانند اثرجبران کانال ها را تنظیم کند. علاوه بر این، نرم افزار تضمین می‌کند که پارامترها به درستی تنظیم شده اند. پنج جزء اصلی یک فلوسایتومتر عبارتند از: محفظه جریان سلول، سیستم اندازه گیری، آشکارساز، سیستم تقویت و نرم افزار کامپیوتری.
مهندسی پروتئین چیست؟
مهندسی پروتئین برای سنتز پروتئین‌های جدید استفاده می‌شود. علاوه بر این، توالی و ساختار پروتئین‌های موجود را می‌توان برای دستیابی به عملکردهای مورد نظر اصلاح کرد. رشته مهندسی پروتئین به طور قابل توجهی از پیشرفت‌ها در زمینه‌های نیروی مولکولی، بیوانفورماتیک ساختاری و افزایش دانش در مورد ساختار پیچیده سه بعدی پروتئین‌ها بهره برده است. رویکردهای محاسباتی به دلیل پیشرفت دانش و فناوری امکان پذیر شده است.
مهندسی پروتئین یک رشته نسبتا جدید است. تحقیقات قابل توجهی برای درک فرآیند folding پروتئین (تاخوردگی) و شناسایی پروتئین برای اطلاع از اصول طراحی پروتئین انجام شده است. استراتژی‌های مهندسی پروتئین به دو دسته تقسیم می‌شوند. تکامل مستقیم و طراحی اصولی پروتئین.
محققان معمولاً هر دو روش را در طول مهندسی پروتئین استفاده می‌کنند. چند رویکرد مهندسی پروتئین شامل هم ترازی توالی چندگانه، آنالیز هم تکاملی، اتصال چند ظرفیتی و پیش‌بینی ساختاری است. مهندسی پروتئین مبتنی بر فناوری DNA نوترکیب است. روش طراحی اصولی کلاسیک شامل جهش‌زایی در مکان است، که در آن توالی‌های اسید آمینه خاص در یک ژن هدف وارد می‌شوند. جهش زایی در مکان را می‌توان با روش همپوشانی مکان یا تک دور PCR پلاسمید کامل، انجام داد.
طراحی اصولی زمانی مفید است که توالی پروتئین مشخص باشد. اما توالی در بسیاری از موارد ناشناخته است، که نیاز به روش‌های تکاملی را مشخص می کند.
پیشرفت‌های تکنولوژیکی اخیر در غربالگری با کارایی بالا فرصت‌هایی را برای پیشرفت این حوزه فراهم کرده است. فلوسایتومتری یکی از تکنیک‌هایی است که می‌تواند داده‌های مرتبطی را ارائه دهد که به مطالعات مهندسی پروتئین کمک می‌کند.چگونه می توان از فلوسایتومتری برای تشخیص مهندسی پروتئین استفاده کرد در سال‌های اخیر، فرصت‌های بزرگی برای استفاده از فلوسایتومتری در مهندسی پروتئین به وجود آمده است.
پروتئین‌ها را می‌توان طوری مهندسی کرد که خواص خاصی مانند اتصال لیگاند، آلوستری، فعالیت کاتالیزوری و پایداری بهبود یافته داشته باشند. فلوسایتومتری می‌تواند نشانگرهای زیستی این پروتئین‌های مهندسی شده را به روشی با کارایی بالا شناسایی کند و صدها یا حتی هزاران ذره را در دقیقه مرتب کند و شمارش کند. سلول‌هایی که حاوی پروتئین مهندسی شده هستند با فلورسنت علامت گذاری می‌شوند و از فلوسایتومتر عبور می کنند، جایی که توسط نرم افزار شناسایی و تجزیه و تحلیل می‌شوند.
اغلب، چندین دور غربالگری برای یافتن پروتئین مهندسی شده با خواص عملکردی مورد نظر ضروری است. این فرآیند چند مرحله‌ای تا زمانی انجام می‌شود که بهبود عملکردی مشاهده شده در پروتئین ناچیز باشد یا پروتئین‌های تولید شده معیارهای انتخاب شده را برآورده کنند. راه‌های متعددی برای تولید تنوع توالی در پروتئین‌های مهندسی شده وجود دارد، از جمله جهش زایی تصادفی، نوترکیبی همولوگ در شرایط آزمایشگاهی، یا نوترکیبی غیر همولوگ.
صرف نظر از روش ایجاد تنوع توالی، مانع اصلی تکنیک‌های مهندسی تکاملی، محدودیت فرآیندهای غربالگری سنتی برای کتابخانه وسیع توالی‌های پروتئین تولید شده در طول مهندسی پروتئین است. فلوسایتومتری به دلیل توانایی آن در تشخیص سریع توالی‌های بیان شده در سلول‌های مهندسی شده، مزایای گسترده‌ای برای مهندسی پروتئین دارد و داده‌های فراوانی را در اختیار محققان قرار می‌دهد که انتخاب پروتئین‌هایی با ویژگی‌های مورد نظر را تسهیل می‌کند. سایر تکنیک‌های مورد استفاده در مهندسی پروتئین عبارتند از نمایش فاژ، سنجش‌های بیولوژیکی که از آنزیم‌های گزارشگر استفاده می‌کنند، و سنجش‌های تک چاهکی.
جمع بندی
مهندسی پروتئین یک زمینه مطالعاتی نسبتاً جدید است که به طور فزاینده‌ای برای تولید پروتئین‌های سفارشی با ویژگی‌های عملکردی مختلف برای اهدافی مانند طراحی دارو استفاده می‌شود. نیاز به تجزیه و تحلیل کتابخانه بزرگ پروتئین‌های مهندسی شده، استفاده از روش‌هایی با کارایی بالا را در این زمینه تسهیل کرده است. فلوسایتومتری یکی از این تکنیک‌هاست که پتانسیل دستیابی به این نیاز را نشان داده و داده‌های لازم برای مطالعات را در مدت زمان کوتاهی فراهم می‌کند.
همچنین بخوانید:
- دوره مهارت آموزی فلوسایتومتری
- تشخیص آنیوپلوئیدی با فلوسایتومتری
- کاربردهای فلوسایتومتری در هماتولوژی
- ایمونوسیتوفلورسنت و آشنایی با فلوسایتومتری
- فیلترهای نوری در فلوسایتومتری و استفاده از آن
