تکنیک ها
آزمایش غیر تهاجمی تشخیص پیش از تولد (NIPT)
استفاده از توالی‌یابی نسل جدید (NGS) برای NIPT
مقدمه
آنالیز DNA آزاد موجود در خون (cfDNA) نوید بخش یک روش غیر تهاجمی برای بررسی بیومارکرهای ژنتیکی است که ممکن است نشان‌دهنده‌ی پیشرفت بیماری باشد، مانند سرطان و برای غربالگری تریزومی جنین در دوران بارداری. طی چند سال گذشته، محققان فرایند گرفتن cfDNA در گردش در پلاسما را اصلاح کردند.
چالش باقی‌مانده یافتن فناوری با حساسیت مورد نیاز برای دسترسی به اطلاعات ژنتیکی موجود در cfDNA بود. توالی‌یابی نسل جدید (NGS) با سطوح بالای حساسیت و دقت آن، کیفیت داده‌ی مورد نیاز برای آنالیز قابل اعتماد مقادیر اندک cfDNA موجود در پلاسمای خون در گردش را تولید می‌کند. نتیجه، دسترسی به این نمونه‌هایی جهت بررسی ژنومی است که قبلا غیرقابل دسترس بودند.
این ضمیمه درباره‌ی موضوع استفاده از فناوری NGS ایلومینا در آزمایش verifi بحث می‌کند، که این آزمایش یک غربالگری پیش از تولد است که آنیوپلوئیدی جنینی را توسط تجزیه و تحلیل cfDNA جنینی به دست آمده از خون مادر تشخیص می‌دهد. براساس این اطلاعات، آزمایشگاه‌ها می‌توانند استفاده از NGS برای NIPT را بهتر درک کنند.
مروری بر آزمایش verifi
در مراحل اولیه‌ی بارداری، cfDNA جنینی تقریبا 3% محتوای ژنومی موجود در DNA پلاسمای مادری را نشان می‌دهد. از طریق قدرت NGS، این DNA جنینی می‌تواند برای شناسایی پتانسیل انحرافات کروموزومی آنالیز شود. Verinata، یک شرکت ایلومینا است که تجربه‌ی غربالگری ده‌ها هزار نمونه‌ی cfDNA را برای ناهنجاری‌های کروموزومی با استفاده از فناوری توالی‌یابی ایلومینای اثبات شده را دارد.
با به کارگیری آزمایش verifi توسعه یافته به صورت داخلی در آزمایشگاه‌شان که توسط CLIA تأیید شده و توسط CAP به رسمیت شناخته شده، دانشمندان آزمایشگاه Verinata به نرخی از شکست کمِ 0.07% با حساسیت بیشتر از 99.99% و اختصاصیت کمتر از 99.8% در تشخیص تریزومی 21 دست یافته‌اند. غربالگری معمولا در کمتر از 4 روز از دریافت نمونه‌ی خون در آزمایشگاه انجام می‌شود.
جریان کار verifi
برای آزمایش verifi، Verinata از یک گردش کار پنج مرحله‌ای استفاده می‌کند که از cfDNA جنینی شروع و با تجزیه تحلیل آن خاتمه می‌یابد (شکل 1). DNA طبق فرایند استاندارد در آزمایش verifi جداسازی و استخراج شد.
Verinata این مرحله را برای پردازش 64-69 نمونه به طور کامل و همزمان خودکار می‌کند. این مرحله می‌تواند به طور دستی برای دسته‌های نمونه‌های 16تایی اجرا شود. برای هردوی روش‌ها، کتابخانه‌هایی با استفاده از یک کیت آماده‌سازی کتابخانه‌ی ایلومینا ایجاد می‌شود، مانند کیت آماده‌سازی کتابخانه‌ی DNA نانو TruSeq®، که برای تولید کتابخانه‌های توالی‌یابی با ورودی‌های کم نمونه بهینه شده است. آزمایش verifi در حال حاضر از سیستم توالی‌یابی HiSeq® 2000 ایلومینا برای تولید داده‌های توالی‌یابی استفاده می‌کند.
ران (run) توالی‌یابی شده خوانش‌های کوتاه از تمام قطعات DNA در نمونه (1 × 25 جفت بازی) ایجاد می‌کند و برای کاهش زمان ران و تهیه‌ی چرخه‌ای سریع از نمونه برای گزارش بهینه شده است (جدول 1). برای یک زمان برگشت حتی سریع‌تر، توالی‌یابی می‌تواند در سیستم HiSeq 2500 ایلومینا در حالت ران-سریع با استفاده از TruSeq Rapid SR Cluster Kit-HS و TruSeq Rapid SBS Kit-HS (50 سیکل) اجرا شود.
Verinata آنالیز داده‌ی اولیه را با استفاده از رایانه ابزار HiSeq آن-بورد (on-board) برای آنالیز اولیه و سرورهای داخلی را برای آنالیز پایین دست و تولید گزارش اجرا می‌کند.
یک الگوریتم به خوبی بهینه شده، براساس روش شمارش که توسط Sehnert AJ و همکاران توصیف شد، یک ارزش کروموزومی نرمال شده (NCV) را برای هر کروموزوم محاسبه می‌کند تا نتایج واضح و آگاهی بخشی را تهیه کند. نتایج با معیارهای کیفی از الگوریتم به آزمایشگاه برمی‌گردند تا هنگام تهیه‌ی یک گزارش استفاده شوند. تمام آنالیزها به صورت داخلی (in-house) انجام می‌شود.
NGS را داخلی‌سازی کنید
آزمایشگاه‌های علاقه‌مند به دنبال کردن این روش NGS می‌توانند یا یک جریان کار پردازش دستی یا یک جریان کار کاملا خودکار که توالی‌یابی ایلومینا را با تنظیمات خودکار ترکیب می‌کند، انتخاب کنند. دانشمندان ایلومینا تمام مراحل جریان کار را برای اطمینان از آسان‌ترین و ساده‌ترین تنظیمات در آزمایشگاه شما آزمایش می‌کنند.
برای مشتریانی که جهت راه‌اندازی زیرساخت‌های محاسباتی و ذخیره‌سازی نیاز به کمک دارند، شرکت ایلومینا سیستم محاسباتی ایلومینا را ارائه می‌دهد. علاوه بر این، دانشمندان متخصص تأیید شده در زمینه‌ی ایلومینا برای اجرای کامل آموزش درون سازمانی و تأیید فنی دردسترس هستند. این خدمت شامل نصب و تأیید اعتبار کامل راه‌اندازی آزمایشگاه و کلیه‌ی تجهیزات استفاده شده در کل جریان کار می‌باشد.
مترجم: صدف حجاران
مطالعه صدها مطلب علمی در حوزه بیولوژی
آرشیو جدیدترین خبرهای روز دنیای بیولوژی
