شناسایی سایتوکاین ها با استفاده از فلوسایتومتری داخل سلولی

فهرست مطالب نمایش

مقدمه‌ای بر شناسایی سایتوکاین ها با استفاده از فلوسایتومتری داخل سلولی

سایتوکاین ها نقش مهمی را به عنوان واسطه پاسخ های ایمنی ایفا می کنند و توسط سلول های مختلف تولید می شوند. روش‌هایی که می‌توانند برای اندازه‌گیری سطوح سایتوکاین در یک نمونه و تمایز بین انواع مختلف آن مورد استفاده قرار گیرند، ابزارهای ضروری برای درک سیستم ایمنی انسان هستند.

روش‌ها و تکنیک‌های بیولوژیکی مختلف برای اندازه‌گیری سطوح سایتوکاین توسعه یافته‌اند. با این حال، همه این سنجش‌ها بر این فرض استوارند که تمام سلول‌های یک فنوتیپ معین و انواع مشابهی از سایتوکاین‌ها را تولید می‌کنند. این اغلب منجر به نتایج مبهم می‌شود و تعیین وجود سلول‌های آلوده در کشت را دشوار می‌کند.

به همین دلایل بود که جستجوی گسترده ای برای روشی وجود داشت که بتواند سلول‌های منفرد را با استفاده از نشانگرهای سطح سلولی و پروفایل‌های تولید سایتوکاین را شناسایی کند. شناسایی سایتوکاین‌های موجود در داخل سلول معمولاً به دلیل سیگنال ضعیف داخل سلولی مشکل ایجاد می‌کند. با این حال، یک مطالعه در سال 1993 سعی کرد از طریق یک روش جدید که اکنون به طور گسترده برای تشخیص سایتوکاین‌های IL-1α، IL-6، IL-8 و TNF-α استفاده می‌شود، این مسئله را حل کند.

موننسین

موننسین یک یونوفور کربوکسیلیک است که فرآیند انتقال درون سلولی را مختل می‌کند. به یون‌های Na+، K+ و H+ متصل می‌شود و شیب یونی در غشاهای بیولوژیکی را مختل می‌کند. این امر کمپلکس گلژی را مختل می‌کند و بدون ایجاد وقفه در سنتز پروتئین به غشای سلولی منتقل می‌شود و متعاقباً منجر به تجمع سایتوکاین‌ها در کمپلکس گلژی و افزایش نسبت سیگنال به نویز می‌شود.

در حین انجام آزمایش، سلول‌های تک هسته‌ای خون محیطی انسان با فوربول میریستات استات (PMA) و یونومایسین فعال شدند. این در غیاب موننسین در گروه شاهد و حضور موننسین در سلول‌های آزمایش انجام شد. چنین عملیاتی با افزایش شدت فلورسانس، نسبت سیگنال به نویز را افزایش داد.

پس از 10 ساعت تحریک، 50٪ لنفوسیت‌ها برای اینترلوکین-2 (IL-2) پس از استفاده از موننسین مثبت شدند، در حالی که تنها 11٪ از سلول‌ها آزمایش IL-2 در غیاب آن مثبت بودند. همچنین، سلول‌های تولیدکننده اینترلوکین 4 (IL-4) در خون محیطی انسان نادر است، اما می‌توان آنها را با استفاده از موننسین شناسایی کرد. با این حال، میانگین شدت فلورسانس IL-4 در مقایسه با شدت IL-2 کمتر بود، که اگر تعداد آنها در مقایسه با IL-2 کمتر باشد، کاملا قابل درک است.

تعیین غلظت بهینه موننسین

افزودن دوزهای بالای موننسین می‌تواند منجر به سمیت شود، بنابراین دوز بهینه برای موننسین باید تعیین شود. برای این کار، موننسین با غلظت های مختلف (از 10 نانومولار تا 100 میکرومولار) استفاده شده است و درصد سلول‌های مرده برای تعیین سطح سمیت مشاهده شده است. نتایج سطح مشخصی از سمیت را در 100 میکرومولار نشان داد که حتی پس از شش ساعت کشت وجود داشت و غلظت‌های کمتر از 1 میکرومولار منجر به مرگ سلولی نشد.

همچنین هنگامی که در غلظت 1 میکرومولار استفاده شد، پس از 24 ساعت سمیت بالایی مشاهده شد و پس از 48 ساعت تقریباً تمام سلول‌ها مرده بودند. افزودن موننسین نشانگرهای سطح سلولی را در آزمایش تغییر نداد.

تشخیص جمعیت محدود با استفاده از فلوسایتومتری سه رنگ

برای ارزیابی سطح و نوع جمعیت سایتوکاین در زیرمجموعه‌ای از سلول‌ها، قبلاً لازم بود سطوح سایتوکاین را با استفاده از ELISA، bioassay یا بیان mRNA جدا و اندازه‌گیری کنیم. در مطالعه فوق الذکر، محققان آزمایش کردند که آیا می‌توانند الگوی سایتوکاین را در یک جمعیت محدود از سلول‌ها با استفاده از فلوسایتومتری تجزیه و تحلیل کنند.

مطالعات قبلی نشان می‌دهد که سلول‌های مختلف، مانند سلول‌های بکر یا خاطره (Memory) انسان، انواع مختلفی از سایتوکاین‌ها را ترشح می‌کنند. سلول ها در ابتدا با استفاده از ترکیبی از پارافورمالدئید (PFA) و ساپونین تثبیت شدند، زیرا اینها خواص پراکندگی را برخلاف Tween 20 و Triton-X تغییر نمی‌دهند. با استفاده از FACS سه رنگ، محققان توانستند تفاوت هایی را در بیان IL-2، IFN-y، و IL-4 در سلول های T خاطره و بکر بیابند.

اعتبار سنجی روش

برای تایید نتایج، محققان مطالعات میکروسکوپی همراه با فلوسایتومتری برای ده نمونه انجام دادند و سطوح IL-2، IFN-y و CD45 را آزمایش کردند. آنها دریافتند که نتایج میکروسکوپی با نتایج فلوسایتومتری همبستگی زیادی دارد. این مقاله یک روش نسبتاً سریع، آسان و حساس را توصیف می‌کند که شامل ۲ تا ۶ ساعت کشت و ۲ تا ۳ ساعت رنگ‌آمیزی برای تشخیص سطوح سایتوکاین‌ها است.

این روش در هر آزمایش فقط به چند سلول (105 سلول) نیاز داشت. همچنین سلول‌های رنگ آمیزی شده برای سایتوکاین‌های مختلف را می‌توان به مدت 1-3 روز در تاریکی نگهداری کرد. بنابراین، این روش وسیله ای برای مشخص کردن سایتوکاین ها در یک جمعیت ناهمگن، غربالگری الگوهای سایتوکاین و مشخص کردن عملکرد سلول های تولید کننده سایتوکاین فراهم می کند.

همچنین بخوانید: