ویکی ژن
سیستم بیانی pET، انواع وکتورها و انتخاب آنها
مقدمه‌ای بر سیستم بیانی pET، انواع وکتورها و انتخاب آنها
سیستم بیانی pET یک سیستم قدرتمند و پرکاربرد برای بیان پروتئین های نوترکیب در E.coli است. ژن مورد نظر در وکتور pET تحت کنترل سیستم تنظیم کننده رونویسی و ترجمه T7 باکتریوفاژ قوی کلون می شود.
فعال سازی بیان با ارائه RNA پلیمراز T7 در داخل سلول به دست می آید. هنگامی که سیستم به طور کامل القا می شود، تقریبا تمام منابع سلول به بیان ژن مورد نظر اختصاص می یابد. تنها با چند ساعت القاء، پروتئین نوترکیب می تواند تقریبا نیمی از کل پروتئین های سلول را تشکیل دهد.
ژن مورد نظر در ابتدا در وکتور pET در میزبان باکتریایی که فاقد ژن T7 RNA پلیمراز است، کلون می شود. این امر به دلیل بیان پروتئین های مورد نظر که ممکن است برای سلول های میزبان مضر باشد، ناپایداری پلاسمید را از بین می برد.
پس از آن، بیان ژن مورد نظر را می توان به دو روش ممکن آغاز کرد. سلول های میزبان را می توان با فاژ حامل ژن RNA پلیمراز T7 به عنوان مثال فاژ λCE6 آلوده کرد، یا به طور معمول، پلاسمید pET را می توان به سویه میزبان باکتری که ژنوم آن برای حمل ژن T7 RNA پلیمراز تحت کنترل مهندسی شده است، آلوده کرد. پروموتر LacUV5 بیان T7 پلیمراز با افزودن IPTG آنالوگ لاکتوز به کشت باکتری القا می شود.
وکتور pET به عنوان یک پلاسمید با تعداد کم کپی در میزبان E. coli وجود دارد که بیان نشت‌کننده را قبل از القا کاهش می‌دهد. این وکتور از سیستم پروموتر T7lac برای بیان ژن قوی و کاملا کنترل شده استفاده می کند. در این سیستم، یک پروموتر T7 وجود دارد که می تواند توسط RNA پلیمراز T7 برای بیان سطح بالایی از ژن مورد نظر عمل کند.
علاوه بر این، یک توالی اپراتور لک (LacO) درست در پایین دست پروموتر T7 وجود دارد که می تواند توسط پروتئین سرکوب کننده لک (LacI) برای جلوگیری از رونویسی پروموتر T7 روی آن اثر بگذارد. این پلاسمید همچنین حامل پروموتر طبیعی و توالی کد کننده LacI است.
پروتئین LacI در پروموتر LacUV5 در سلول های میزبان عمل می کند تا بیان ژن T7 RNA پلیمراز توسط پلیمراز میزبان را سرکوب کند و همچنین در پروموتر T7lac بر روی ناقل pET عمل می کند تا رونویسی ژن مورد نظر توسط هر RNA پلیمراز T7 را مسدود کند. که ممکن است به دلیل نشت بیان ایجاد شود. افزودن IPTG مانع از عمل بازدارندگی LacI می‌شود، در نتیجه بیان T7 RNA پلیمراز را القا می‌کند و همچنین مهار LacI را از ژن مورد نظر حذف می‌کند.
اگرچه سیستم بیان pET برای بیان پروتئین نوترکیب سطح بالا طراحی شده است، سطح بیان را می توان با کاهش مقدار IPTG عرضه شده به سلول های میزبان کاهش داد که می تواند هنگام بیان پروتئین هایی با حلالیت محدود مفید باشد. علاوه بر این، سیستم قادر است ژن مورد نظر را در حالت رونویسی خاموش در زمانی که T7 RNA پلیمراز وجود ندارد، حفظ کند.
همه وکتورهای pET سفارشی در یک سویه E. coli طراحی شده برای به حداکثر رساندن یکپارچگی پلاسمید و فاقد ژن T7 RNA پلیمراز عرضه خواهند شد. برای تولید پروتئین نوترکیب، توصیه می‌کنیم ناقل را به سویه‌های باکتری میزبان BL21(DE3) یا HMS174(DE3) که حامل نسخه‌های کروموزومی ژن RNA پلیمراز T7 است که توسط پروموتر LacUV5 هدایت می‌شود، منتقل کنید.
استفاده از میزبان‌های حامل پلاسمیدهای pLysS یا pLysE ممکن است در مواردی مفید باشد. این پلاسمیدها با تولید لیزوزیم T7 که یک مهارکننده RNA پلیمراز T7 است، بیان پایه ژن مورد نظر را سرکوب می کنند.
مزایای سیستم بیانی pET
- بیان قوی: سیستم تنظیمی رونویسی و ترجمه T7 امکان تولید سطح بسیار بالایی از پروتئین های مورد نظر را فراهم می کند که در بسیاری از موارد نزدیک به 50 درصد کل پروتئین در کشت است.
- بیان کاملا کنترل شده: بیان ژن مورد نظر به طور کلی در غیاب IPTG اضافه شده به شدت سرکوب می شود و این حالت خاموش برای اکثر ژن های مورد هدف در اکثر سویه های میزبان بسیار قوی است.
معایب سیستم بیانی pET
- الزامات میزبان: وکتورهای pET تکمیل شده باید در یک سویه E. coli فاقد ژن RNA پلیمراز T7 نگهداری شوند و باید قبل از القای بیان پروتئین به سویه میزبان جداگانه حاوی ژن T7 RNA پلیمراز منتقل شوند.
حتی در غیاب IPTG، ممکن است مقداری بیان سطح پایین RNA پلیمراز T7 از پروموتر LacUV5 در برخی از سویه های میزبان بیانی وجود داشته باشد که می تواند منجر به سمیت باکتریایی برای ژن های خاص مورد هدف در میزبان خاص شود.
اجزای کلیدی
- پروموتر T7: وقتی RNA پلیمراز T7 وجود دارد، رونویسی در سطح بالایی از ژن مورد نظر را هدایت می کند. هنگامی که بلافاصله در بالادست یک عنصر LacO قرار می گیرد، کل کست به عنوان پروموتر T7lac شناخته می شود.
- LacO: محل اتصال برای LacI. این عنصر فعالیت پروموتر T7 را هنگامی که پروتئین LacI وجود دارد، مهار می کند و از بیان نشتی ژن مورد نظر جلوگیری می کند.
- RBS: محل اتصال به ریبوزوم و عنصر شروع ترجمه از باکتریوفاژ T7 که امکان تولید موثر پروتئین مورد نظر را فراهم می کند.
- ORF: چارچوب خوانش باز ژن مورد نظر در اینجا قرار داده شده است.
- پایان دهنده T7: توالی سیگنال برای خاتمه رونوشت ساخته شده از ژن مورد نظر.
- ژن مقاومت به آمپی سیلین: اجازه می دهد تا پلاسمید با انتخاب آمپی سیلین در E. coli حفظ شود.
- pBR322 ori: مبدا همانندسازی می باشد. پلاسمیدهای حامل این منشاء و همچنین ژن Rop در تعداد کم کپی در E. coli وجود دارد.
- Rop: بازدارنده پرایمر می باشد که پروتئین کوچکی را کد می کند که تعداد کپی پلاسمید را تنظیم می کند. وجود پروتئین Rop در ترکیب مبدا تکثیر pBR322 بر روی پلاسمید، منجر به تعداد کم کپی پلاسمید می شود.
- LacI: پروموتر طبیعی E. coli و توالی کد کننده برای سرکوب کننده lac. در غیاب عامل القا کننده سیستم مانند IPTG، پروتئین LacI رونویسی ژن مورد نظر از پروموتر T7lac و همچنین رونویسی RNA پلیمراز T7 از پروموتر LacUV5 در سویه های میزبان مورد استفاده برای تولید پروتئین نوترکیب را سرکوب می کند.
صفحات مرتبط:
