هیستوپاتولوژی چیست؟

بافت شناسی که تحت عناوین آناتومی میکروسکوپی یا میکروآناتومی شناخته می شود ، شاخه ای از زیست شناسی است که آناتومی میکروسکوپی بافت های بیولوژیکی را مطالعه می کند.

بافت شناسی پزشکی

هیستوپاتولوژی شاخه ای از بافت شناسی است که شامل بررسی میکروسکوپی و مطالعه بافت بیمار است. این یک قسمت مهم از آسیب شناسی آناتومیک و آسیب شناسی جراحی است ، زیرا تشخیص دقیق سرطان ها و سایر بیماری ها اغلب به بررسی هیستوپاتولوژیک نمونه های بافتی نیاز دارد. پزشکان آموزش دیده و آسیب شناسان ، معاینات هیستوپاتولوژی را انجام می دهند و اطلاعات تشخیصی را براساس مشاهدات خود ارائه می دهند.

آماده سازی نمونه

تثبیت

تثبیت کننده های شیمیایی به منظور حفظ بافت و ساختار سلول ها استفاده می شوند. تثبیت کننده ها، سبب سفت شدن بافت ها نیز می شوند که هنگام برش زدن بافت به بخش های نازک جهت مشاهدات میکروسکوپی، بسیار کمک کننده است. فیکساتیو ها به طور کلی با اتصال غیرقابل برگشت با پروتئین ها ، بافت ها (و سلول ها) را حفظ می کنند. فیکساتیو هایی که برای میکروسکوپ نوری به کار می روند، عمدتا 10% بافر فرمالین خنثی یا  NBF (4٪ فرمالدئید در محلول بافر فسفات) است.

در میکروسکوپ الکترونی ، متداول ترین ماده فیکساتیو، گلوتارآلدئید است که معمولاً به عنوان محلول 2.5٪ در محلول نمکی بافر فسفات است. سایر فیکساتورهای مورد استفاده برای میکروسکوپ الکترونی ، تتروکسید اوزیم یا اورانیل استات است.

وظیفه اصلی این فیکس کننده های آلدئیدی ، اتصال بین گروه های آمین در پروتئین ها از طریق تشکیل پل های متیلنی (-CH2-) ، توسط فرمالدئید ، یا توسط اتصالات عرضی C5H10 توسط گلوتارآلدئید است. این فرآیند ، ضمن حفظ یکپارچگی ساختاری سلول ها و بافت می تواند به عملکرد بیولوژیکی پروتئین ها ، به ویژه آنزیم ها آسیب برساند.

فرایند فیکس شدن در فرمالین منجر به تخریب mRNA ، miRNA ، DNA و نیز دناتوراسیون و اصلاح پروتئین ها در بافت ها می شود. با این حال ، استخراج و تجزیه و تحلیل اسیدهای نوکلئیک و پروتئین ها از بافت های غوطه ور شده در فرمالین و پارافین با استفاده از پروتکل های مناسب امکان پذیر است.

انتخاب و جدا سازی

انتخاب بافت مربوطه در مواردی مطرح است که لازم نیست کل توده بافت اصلی مورد پردازش و مطالعه قرار گیرد. باقیمانده بافت جدا شده ممکن است در صورت نیاز به بررسی در آینده به صورت فیکس شده نگهداری شود.

پیرایش و جدا سازی برش نمونه های بافتی، مرحله ای است که در آن سطح مناسب برش نمایان می شود و نمونه های بافتی را با اندازه ای مناسب ایجاد می کند تا در کاست ها قرار گیرند.

قالب گیری

بافت ها، هم به منظور داشتن تکیه گاه و هم به منظور ایجاد سهولت در هنگام برش گیری های نازک، نیاز است تا آن ها را قالب گیری کرد. به طور کلی ، ابتدا باید آب را از بافت ها خارج کرد (آن ها را دهیدراته کرد) و سپس جای خالی آب را با ماده ای مناسب جایگزین کرد که بافت جامد شود.

واکس پارافین

به منظور بررسی با میکروسکوپ نوری، رایج ترین ماده جایگزین آب، موم پارافین است. پارافین در آب غیر محلول است و آب اصلی ترین ماده تشکیل دهنده بافت های بیولوژیکی است. به همین ترتیب نیاز است تا توسط فرآیند های دهیدراسیون، آب موجود در بافت از بین برود. برای آب گیری، نمونه ها را در ظروف اتانول با درصد های مختلف قرار می دهند تا به تدریج آب موجود در آن از بین برود. فرآیند آب گیری از اتانول با درصد پایین شروع می شود و تا اتانول مطلق 100 درصد پیش می رود. پس از آب گیری مرحله شفاف سازی انجام می شود که معمولا تویط زایلن است. این ماده الکل را از بین می برد و قابلیت انحلال در پارافین را دارد. سپس موم پارافینی ذوب شده به بافت ها اضافه می شود که جای زایلین را می گیرد و به بافت ها نفوذ می کند. در بیشتر آزمایشگاه های پاتولوژِی فرآیند آماده سازی بافت به کمک دستگاه های پردازشگر اتوماتیک انجام می شود.  پس از نفوذ پارافین در بافت، آن ها در قالب هایی که با موم پر شده اند قرار می دهند و سپس اجازه می دهند تا موم خنک شود و و پس از سفت شدن، بلوک گیری شود.

سایر مواد جایگزین

موم پارافینی برای برش بخش های بسیار نازک (که به ویژه برای میکروسکوپ الکترونی بسیار مهم است) بستر مناسبی را فراهم نمی کند. به عنوان مثال، گرمای موم ذوب شده ممکن است اثرات نا مطلوبی را بر روی بافت بگذارد و یا مواد شیمیایی به کار رفته در حین آب گیری، می تواند سبب آسیب بافتی شود. از گزینه های جایگزین برای موم پارافینی، می توان به اپوکسی ، اکریلیک ، آگار ، ژلاتین ، سلوئیدین و انواع دیگر موم ها اشاره کرد.

در تکنیک میکروسکوپ الکترونی ، رزین های اپوکسی متداول ترین مواد جایگزین پارافین هستند. اما از رزین های اکریلیک نیز استفاده می شود ، خصوصاً در مواردی که نیاز به ایمونوهیستوشیمی است.

برای برش بافت ها در حالت منجمد، بافت ها در یک محیط تعبیه شده بر پایه آب قرار می گیرند و به شکل بلوک های سخت شده در می آیند.

برش زنی

در بررسی با میکروسکوپ نوری ، از تیغه ای سوار شده در میکروتوم استفاده می شود که به طور معمول بافت ها را در ضخامتی بین 5 الی 15 میکرون برش می زنند. سپس آن ها را بر روی اسلاید شیشه ای قرار می دهند. در تکنیک میکروسکوپی الکترونی عبوری TEM از یک تیغه الماس یا اولترامیکروتوم برای برش استفاده می شود که برش های 50 تا 150 نانومتری می دهد.

رنگ آمیزی

بافت بیولوژیکی کنتراست کمی در میکروسکوپ نوری یا الکترونی دارد. به همین منظور از رنگ آمیزی برای ایجاد کنتراست در بافت و نیز برجسته کردن ویژگی های خاص آن استفاده می شود.

بررسی با میکروسکوپ نوری

هماتوکسیلین و ائوزین (رنگ H&E) یکی از رایج ترین رنگ ها در بافت شناسی است که ساختار کلی بافت را نشان می دهد. هماتوکسیلین هسته سلول را به رنگ آبی رنگ آمیزی می کند. ائوزین ، یک رنگ اسیدی است که سیتوپلاسم و سایر بخش های بافتی را صورتی رنگ می کند.

بر خلاف H&E که به عنوان یک رنگ عمومی استفاده می شود ، روش های زیادی وجود دارد که سلول ها ، اجزای سلولی و مواد خاص را به صورت انتخابی و با اختصاصیت بیشتری رنگ آمیزی می کند. به عنوان نثال رنگ آمیزی آبی پروس Perls است که برای رنگ آمیزی رسوب آهن در بیماری هایی مانند هموکروماتوز است. روش Nissl برای ماده Nissl و روش Golgi در شناسایی سلول های عصبی مفید هستند.

ایمونوهیستوشیمی

اخیراً از آنتی بادی ها برای بررسی اختصاصی پروتئین ها ، کربوهیدرات ها و چربی ها استفاده می شود. به این فرآیند ایمونوهیستوشیمی می گویند. اگر مولکول فلئورسنت باشد به آن رنگ آمیزی ایمونوفلورسانس می گویند. سایر تکنیک های پیشرفته ، مانند هیبریداسیون غیر رادیواکتیو، می توانند مولکول های DNA یا RNA خاصی را با پروب های فلورسنت یا برچسب هایی که می توانند برای ایمونوفلورسانس و تقویت فلورسانس متصل به آنزیم (به ویژه تقویت سیگنال آلکالن فسفاتاز و تیرامید) استفاده شوند ، شناسایی کنند. میکروسکوپ فلورسانس و میکروسکوپ کانفوکال برای تشخیص سیگنال های فلورسنت استفاده می شود.

میکروسکوپ الکترونی

برای میکروسکوپ الکترونی معمولاً از فلزات سنگین برای رنگ آمیزی مقاطع بافتی استفاده می شود. از اورانیل استات و سیترات سرب معمولاً برای ایجاد کنتراست با بافت در میکروسکوپ الکترونی استفاده می شود.